生活中的分子

多功能显色剂——茚三酮(Ninhydrin)

引言

有机合成实验中,薄层色谱(Thin Layer Chromatography,TLC)是一种基础且常用的分析分离方法,为了观察这些物质在色谱带上的位置,我们最常用的方法是在紫外灯下观察。然而,并非所有的化合物都具有紫外吸收,有时我们也需要对色谱带上的物质进行初步判断,这时TLC显色剂就发挥了重要作用。实验中经常用到的显色剂包括高锰酸钾、磷钼酸、2, 4-二硝基苯肼、香草醛、碘单质、茚三酮等,这些显色剂具有广谱显色性质或只能和特定种类的物质发生显色反应,其中茚三酮就是一种氨基化合物的特定显色剂,它与氨基作用后会显示出独特的蓝紫色——罗曼紫(Ruhemann’s purple),凭借这一性质茚三酮被广泛用于胺类化合物,特别是氨基酸和多肽化合物的检测,在刑侦领域也是鉴定指纹的重要手段。

经茚三酮显色后的氨基酸片段

茚三酮的发现

纵观科学史,有很多重要的发明和发现均是源于意外和偶然,茚三酮也是如此,只不过这段历史以及它的发现者都鲜为人知罢了。德裔英国化学家Siegfried Ruhemann发现茚三酮其实是源于他对烯醇化环状羰基化合物的研究兴趣,那时他发现化合物I主要以烯醇形式存在并且推测环外的乙酰基对烯醇互变有影响。为了验证这一猜想,他设计了具有相似结构的化合物II,并决定采用1-茚酮(1-indanone)为起始原料进行合成。根据最初设想,1-茚酮被4-亚硝基二甲苯胺(4-nitroso dimethylaniline)氧化后得到的亚胺中间体水解即可得到邻二酮产物。然而事与愿违,他们始终没法合成期待的亚胺中间体,后来才发现1-茚酮的两个亚甲基均参与了反应——实际得到的是双亚胺中间体,水解后得到了三酮的单水合物(monohydrate of triketone),Ruhemann根据产物无色的性质排除了邻二酮结构的可能。

茚三酮的发现过程

茚三酮的显色原理

胺类化合物与茚三酮作用后会显色的独特现象究竟是如何被Ruhemann发现的我们已经不得而知,如今只能窥探到他最初记载的关键信息:“Of especial interest is the action of ammonia on the triketone. If the aqueous solution of the mixture of both substances is kept for a short time it turns a deep reddish-violet…”。而这种有颜色的物质Ruhemann认为是包含两个茚三酮片段的某种亚胺,这与现代化学的观点一致。当他正要对茚三酮及其显色原理进行更深入和系统性研究时,恰逢一战爆发后英国国内“反德”情绪高涨,Ruhemann不得不辞职回到德国。

现在人们已经对茚三酮与氨基酸作用后的显色机理有了清楚认识,茚三酮首先脱水与氨基缩合得到亚胺(Schiff base),因此只有氨或伯胺才能发生此步反应,随后亚胺脱羧后异构化为另一种形式的亚胺,水解后释放出出一分子伯胺和一分子醛。伯胺进一步与茚三酮发生缩合得到二聚的亚胺衍生物从而显示出被我们称之为“Ruhemann’s purple”的颜色。需要指出的是,并非所有氨基酸及具有游离a-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质,例如脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应后则会产生黄色物质。遗憾的是,尽管茚三酮也可以检测二级胺,但对其显色机理目前还有很多不清楚的地方,也尚未有统一的说法。

茚三酮与氨基酸作用的显色原理

茚三酮的应用

茚三酮独特的显色特性使其在胺类化合物的检测,特别是氨基酸的检测上有重要应用,它与氨基酸的反应被称为茚三酮反应(Ninhydrin Reaction),该反应十分灵敏并且可根据生成的蓝紫色深浅在特定波长下进行比色测定样品中氨基酸的含量。茚三酮还可用来监测固相肽合成中的脱保护过程(Kaiser测试):肽链的碳端与固相基质连接后利用氮端扩展肽链,当脱去氮原子上的保护后,茚三酮测试呈蓝色,此外氨基酸残基是在氮端被保护的情况下接入肽链的,因此如果下一个氨基酸残基成功连接到肽链,茚三酮测试则出现无色或黄色。

茚三酮显色后的氨基酸和指纹

对遗留在物体表面的指纹进行提取和鉴定是侦破案件的重要依据,目前识别潜在指纹的方法大体上可分为物理和化学方法,茚三酮就是一种被广泛使用的化学方法。由于指纹中含有氨基酸等成分,与茚三酮作用后就会显色,原理正是上文提到的一系列化学反应。指纹的茚三酮显色法早在1954年就被瑞典科学家Oden提出和使用,现阶段仍是常用方法之一,特别是对纸张表面的指纹检出效果好,但该方法也受限于指纹中氨基酸的含量,氨基酸含量如果过低则会影响最终的检出效果。需要注意的是,茚三酮在使用的时候要避免接触皮肤,因为皮肤表面含有微量氨基酸成分,一旦遇到茚三酮同样会被染色。

皮肤被茚三酮染色

染料业的遗憾

19世纪后期,许多化学家都将精力集中在合成染料领域,特别是威廉•珀金(William Henry Perkin)意外发现的苯胺紫染料极大促进了染料工业的发展。1878年,阿道夫·冯·拜尔(Adolf von Baeyer)成功合成了被称为靛蓝(Indigo)的染料,也因此获得1905年诺贝尔化学奖。靛蓝与产生罗曼紫的化合物结构相像,但其合成成本更低廉因此更具市场潜力,罗曼紫则因为高成本最终遗憾没能成为应用普及的染料。

苯胺紫B和靛蓝的结构

参考资料

  • [1] West, Robert. “Siegfried Ruhemann and the discovery of ninhydrin.” J. Chem. Educ. 1965, 42, 386-387. DOI: 10.1021/ed042p386
  • [2] 陈忠云.a-氨基酸和茚三酮显色反应机理[J].教材通讯, 1991 (02): 36-37.
  • [3] 陈艳, 张春静, 高东梅, 杨帆, 韩冬雪, 牛利. 潜指纹显现方法研究进展[J].应用化学, 2011, 28 (10): 1099-1107.
  • [4] Friedman, Mendel. “Applications of the ninhydrin reaction for analysis of amino acids, peptides, and proteins to agricultural and biomedical sciences.” J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 385-406. DOI: 10.1021/jf030490p

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