导读：

近日，西湖大学叶宇轩教授团队将传统的氧化还原酶（黄素依赖型“烯”还原酶（EREDs））进行重新编辑，获得新型异构酶，其可催化炔酸酯发生氧化还原中性的立体选择性 1,3 质子转移，成功构建了一系列具有不同结构的手性联烯酸酯。本工作首次将EREDs拓展为轴向手性构建的质子转移酶催化平台。

“Repurposing “Ene”-Reductase to Isomerase for Enantiodivergent Synthesis of Allenoates

Heli Cheng, Kun Zhang, Pen Chang, Tianyu Zhu*, Yuxuan Ye

J. Am. Chem. Soc. 2026. DOI: 10.1021/jacs.5c19848”

正文

手性联烯酸酯是广泛用于制药、农药和材料等领域的重要手性砌块。其独特反应性源于活化的累积双键体系（即正交排列的共轭π系统），赋予其高亲电性与轴向手性特征，因而可作为构建复杂立体分子的合成子。其中，轴向手性向中心手性的转移反应（Figure 1a）能一步构建含多个立体中心的复杂骨架，因而其备受关注。目前，通过炔丙基1,3-质子转移的对映选择性异构化，成功将非手性炔酸酯的α-质子立体选择性地迁移至γ-位，进而为构建手性联烯酸酯提供是一条简洁高效的合成路径。尽管手性小分子碱催化剂已实现该转化（图1b），但酶催化凭借操作简便、易于规模化制备和可定向进化等优势，使得该策略为手性联烯酸酯的的绿色合成及合成生物学应用提供更具潜力的新途径。

炔丙基1,3-质子转移反应在多种生物化学过程中普遍存在且至关重要，如萜类化合物的生物合成和生物降解。天然酶（如Δ⁵ -3-ketosteroid isomerase (KSI),β-hydroxydecanoyl thiol ester dehydrase和 muconolactone Δ-isomerase）虽能高效催化该反应，且因产物抑制而不适用于联烯酸酯的合成（图1b）。然而，lipases和 nitrile hydratases等非异构酶可耐受联烯醇/联烯酸，抑制微弱。基于此，科学家可利用非异构化酶催化1,3-质子转移有望规避产物抑制，进而实现从炔酸酯出发直接合成手性联烯酸酯。黄素依赖型“烯”还原酶（EREDs）不仅可催化氧化还原反应，还可催化氧化还原中性反应（如异构化），进而表明其具有潜在的多功能属性。此前Hall组已证实EREDs可催化烯丙基1,3-质子转移构建中心手性。

近日，西湖大学叶宇轩教授团队将传统的氧化还原酶（黄素依赖型“烯”还原酶（EREDs））进行重新编辑，获得新型异构酶，其可催化炔酸酯发生氧化还原中性的立体选择性 1,3 质子转移，成功合成了一系列具有不同结构的手性联烯酸酯。该策略无需手性作为起始原料，无明显产物抑制，凸显EREDs在质子转移催化应用中尚未开发的潜力。

首先，作者以4-苯基丁-3-炔酸甲酯（1）作为模型底物，对ERED酶库进行了筛选。研究结果表明，1）对照实验表明无酶几乎不发生异构化（Figure 2a，entires 1–2）；2）多数ERED无催化活性；OYE2、OYE3、XenB和GsOYE则表现出显著催化活性（Figure 2a，entires 3-6）；3）对羰基去饱和突变库筛选发现，不同GsOYE变体可实现对映发散性合成：GsOYE-N27M-Y346I以64%产率和98:2 er生成(R)-1a，而GsOYE-T25S以23% 产率和2:98 er生成(S)-1a（Figure 2a，entires 3-6）。 进一步对GsOYE进行定向进化（Figure 2c），以提高反应的效率。即对GsOYE-N27M-Y346I进行定向进化获得五重突变体GsOYE1（N27M/Y66R/W100L/F233Y/Y346V），其可催化1成功获得(R)-1a（78% yield， 98:2 er）。而对GsOYE-T25S进行定向进化得到六重突变体GsOYE2（T25S/N27C/Y66H/M234H/N270M/F345V），其可催化1获得(S)-1a （83% yield，5:95 er）。

在最优条件下，作者对底物的兼容性进行考察（Figure 3）。多种3-丁炔酸酯均可反应，高效生成相应(R)-和(S)-联烯酸酯。如苯环上含2-F（2a）、3-OMe（3a）、4-CO₂Me（4a）、4-Br（5a）、4-OCF₃（6a）、4-CN（7a）或4-COCH₃（8a）取代基的底物均可兼容。α-取代外消旋底物经酶促动力学拆分，选择性转化单一构型手性联烯酸酯（9a）和(10a)。炔酸乙酯（11a）和炔酰胺（12a）同样适用，而二烯酮（13a）因显著非酶背景反应仅得消旋产物。此外，烷基取代炔酸酯（14a–16a）同样可兼容，而其由明显的(R)-对映体偏好。

另外一方面，作者对2-丁炔酸酯的底物兼容性进行了研究（Figure 3）。特别的是，同一酶催化3-丁炔酸酯与2-丁炔酸酯时，生成相反构型的联烯酸酯：GsOYE1对3-丁炔酸酯1给出(R)-1a，而对2-丁炔酸酯17则给出(S)-1a（95% yield，2:98 er）；GsOYE2则选择性生成(R)-1a（95% yield，95:5 er）。经优化，GsOYE4和GsOYE11性能最优：GsOYE4以99% yield、98:2 er获得(R)-1a；GsOYE11以97% yield、2:98 er获得(S)-1a。该质子转移反应在制备规模上高效运行，使用冻干GsOYE11细胞裂解液一次性制得90 mg (S)-1a。2-丁炔酸酯苯环上多种取代基（4-Br 5a、4-F 19a、4-CO₂Me 4a、4-NC(O)Me₂ 21a、3-Me 22a、3-Cl 23a、3-OCF₃ 24a）均兼容。噻吩（25a）、2-甲氧基吡啶（26a）和3,5-二甲基异噁唑（27a）等杂环底物亦适用。乙基二烯酸酯（11a）和炔酰胺（12a）同样顺利转化。但芳基与炔键间隔一个亚甲基的同系物，或缺失直接共轭羰基的类似物，均无反应活性。

其次，对于苯环带有烯烃的底物时，该催化体系可引发一种自发的分子内[2 + 2]环加成，从而以优秀的产率，优异的对映和非对映选择性获得相应的苯并呋喃衍生物（Figure 4a）。同时，（S）-1a 可与苯甲醛和胺原位缩合形成的亚胺发生分子间[3 + 2]环加成反应（Figure 4b），进一步展示手性联烯酸酯在合成方面的潜力。此外（S）-1a 与环戊二烯顺利发生分子间[4 + 2]环加成（狄尔斯-阿尔德反应），有效地生成了相应的endo-37 和exo-38 双环[2.2.1]庚烯衍生物（Figure 4b）。

接下来，作者通过一系列实验对反应机理进行研究。该反应可通过两种机制发生：即1）单碱机制（one-base mechanism）：单个活性位点残基同时充当广义碱和酸。在反应过程中，17 的γ位质子转移到α位，与缓冲溶液的质子交换不显著；2）双碱机制（two-base mechanism）：两个活性位点残基分别充当广义碱和酸。质子转移过程中，α位质子最终源自缓冲液。17的氘代实验表明(Figure 5a)：GsOYE4 通过单碱基机制形成（R）-对映体，而 GsOYE11 则通过双碱基机制提供（S）-对映体。另外一方面，作者通过定向进化鉴定催化中起酸/碱作用的活性位点残基（Figure 5b）。结果表明： GsOYE4的Y179，以及GsOYE11的Y233和N177为关键残基；而GsOYE4-H66F和GsOYE11-H174F突变导致活性显著下降。此外，对反应后回收的酶进行HRMS分析表明，GsOYE4和GsOYE11分别有45%和18%被底物1a共价修饰。进一步通过四极杆-轨道阱质谱定位到GsOYE4-H66和GsOYE11-Y233为最高概率修饰位点，证实二者紧邻1a的亲电中心，从而证明二者在催化过程中起着重要作用。

另外一方面，进一步探究黄素辅因子在质子转移中的作用。结果表明：（1）利用NADP⁺/GDH/葡萄糖系统将FMNₒₓ还原为FMNₕ_q，完全抑制GsOYE4活性，并显著削弱GsOYE11活性（Figure 5c，entires 1–2）；（2）GsOYE4的黄素结合残基R226A突变体纯化后仅含<5% FMNₒₓ，完全丧失催化能力；外源添加FMNₒₓ可部分恢复活性（Figure 5c，entry 3）。综上，结合态FMNₒₓ对质子转移至关重要。

最后，作者通过DFT计算对反应机理进行研究（Figure 5d）。即对于(R)-1a（GsOYE4）：GsOYE4中的Y179依次作为广义碱/酸，去质子或再质子化均可能主导速率决定步骤。而对于(S)-1a（GsOYE11）来讲，水分子直接参与质子传递。能量分解分析（EDA）进一步揭示了FMNₒₓ的核心催化作用：即FMNₒₓ通过稳定阴离子中间体显著促进去质子化，此与FAD依赖型酰基辅酶A脱氢酶研究一致：FADₒₓ可降低α-质子解离能垒约20 kcal/mol，使pKₐ下降4–5个单位。

总结

西湖大学叶宇轩教授团队将传统的氧化还原酶（黄素依赖型“烯”还原酶（EREDs））进行重新编辑，获得新型异构酶，其可催化炔酸酯发生氧化还原中性的立体选择性 1,3 质子转移，成功构建了一系列具有不同结构的手性联烯酸酯。机理研究表明：通过定向进化获得的GsOYE突变体可分别采用单碱或双碱机制实现质子转移。本工作首次将EREDs拓展为轴向手性构建的质子转移酶催化平台。

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