本文作者：海猫

导读

近日，苏黎世联邦理工学院的Parlo Arosio教授课题组在Angewandte Chemie杂志上发表论文，报道了一个功能化具有内在无序蛋白域的无机纳米颗粒的策略。这些蛋白序列被定义为低复杂度域（LCDs），编码了分子间相互作用力，可以响应环境变化，驱动高度可控的动态自组装性质。LCDs的特性可以转移到无机纳米颗粒上，从而诱导可控的动态相分离，对离子强度和pH值可以做出响应。他们将磁性纳米粒子与由LCD域与球状酶组成的多域蛋白杂交，生成动态蛋白质复合物区室，可以局部限制杂交化学酶反应，并响应外部磁场和溶液条件的变化。

Adaptive Chemoenzymatic Microreactors Composed of Inorganic Nanoparticles and Bioinspired Intrinsically Disordered Proteins

Umberto Capasso Palmiero, Andreas M. Küffner, Frank Krumeich, Lenka Faltova, and Paolo Arosio

Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 1-6 DOI: 10.1002/anie.202000835

正文

蛋白质和无机纳米颗粒的超分子组装体是一类多功能的复合材料，吸引了人们的注意。生物和无机材料具有完全不同的性质，它们的组装体显示出这两种材料结合的特别的性质。例如生物系统通常是动态且活跃的，会根据周围的环境快速的做出反应，适应和进化。细胞在特定的环境下可以生成无膜的动态体系。这些无膜的细胞器是蛋白质和核酸通过液体-液体的相分离形成的，参与了一系列生物功能与功能失调的现象。大部分和这个体系相关的蛋白质都含有低复杂度区域（LCDs）或低复杂度序列（LCSs），即富含特定氨基酸的内在无序域。与复杂的、依赖于静电相互作用的凝聚层相对比，这些序列调控了一系列弱的分子间相互作用力，与分解导致的熵的改变相竞争。这些相互作用力，比如静电，pi-阳离子，芳香族和氢键，使得细胞可以快速的对环境做出反应，调控相分离的进程和产生的体系的性质。并且这些相互作用可以被一系列内在和外在的因素调控，比如单个位点突变，pH值和离子强度的改变等。因此，LCDs为在时间和空间上控制相分离提供了一个机会，并使在复杂体系中调控成为可能，在材料科学上有重要的意义。

因此，作者将LCDs的动态性和适应性整合到了无机纳米颗粒中，产生的复合材料具有可控的自组装性质，并可以对外界环境刺激做出反应。作者将酶与磁性纳米颗粒相结合，制备出了一个可以对外加磁场做出反应、改变其形态的复合体系，可以作为杂交化学酶微反应器。这个体系是一个新的多功能杂交生物无机材料，具有高度可控自组装行为，并可对刺激做出反应。

首先，作者使用了源自DEAD-box解旋酶蛋白LAF-1中的LCDs浸涂在磁性纳米颗粒表面。LAF-1蛋白是第一批在生物学中与液相分离相关的蛋白质之一，已经在体内外进行了表征。这些LCDs富含极性氨基酸，可以介导pi-阳离子，疏水和静电相互作用。该研究团队在以前已经证明了球形域与源于DEAD-box蛋白的LCDs结合会产生多域蛋白，并通过相分离生成动态液滴。因此，作者将LAF-1的LCDs与球形酶腺苷酸激酶结合在一起，以将LCD的自组装性质与酶活性相结合（Figure 1A，序列详见SI）。然后，他们将纳米颗粒用多域蛋白功能化，该过程是基于结合在纳米颗粒表面的抗His-Tag的抗体与常规的His-Tag重组蛋白之间的非共价作用力（Figure 1A）。这些纳米颗粒的尺寸分布很广，使用动态光散射、扫描电子显微镜和投射电子显微镜表征，平均直径为52±15 nm（Figure 1A和SI）。

作者希望对纳米颗粒修饰LCDs可以将蛋白质本身的自组装性质赋予到蛋白质-纳米颗粒复合物上，因此使用光散射，投射电子显微镜和光学显微镜来证实他们的猜想（Figure 1B和SI）。他们发现，蛋白质-纳米颗粒复合物会自组装生成固体状的微米级别的团簇，无机纳米颗粒嵌在富含蛋白质的相中（Figure 1B和SI）。作者用纳米颗粒和不含LCDs的酶AK做了相同的实验，证明了这些团簇是因为LCDs介导的相互作用力而聚集的。然后，他们通过将纳米粒子添加到预先配置好的LAF1AK-LAF1液滴溶液中，进一步验证了磁性纳米颗粒与蛋白质的结合。他们观察到纳米粒子在连续相中吸引了多域蛋白质，溶解了富含蛋白质的液滴并形成了包含纳米粒子的固体状团簇（详见SI）。

与单个蛋白质的行为相似，我们观察到在高的离子强度下，功能化的纳米颗粒在几天内还保持稳定。相反，离子强度的下降导致在微米尺寸范围内形成蛋白质和纳米粒子簇（Figure 2A）。裸露的嵌合蛋白形成的液滴数量和复合团簇的大小都随着离子强度的降低而增加，这表明在高盐浓度下筛选吸引静电相互作用力的重要性。

接下来，作者测定了pH值对于溶液自组装的影响（Figure 2B）。他们观察到相分离会发生在pH为5-9的范围中，而在更酸或更碱性的情况下溶液会保持单一相。pH对于自组装的影响与纳米颗粒/蛋白质复合物和单独的蛋白质类似，可能是因为带电荷和极性的LCDs残基与部分带电的氨基酸和酪氨酸分别调控了静电相互作用和pi-阳离子相互作用力。

这些结果表明，与生物学的LCDs类似，作者设计的新颖的杂交生物无机材料对pH和离子强度比较敏感，使得该材料可以迅速的对周围环境做出反应。然后他们设计了一个“pH钟”，pH值随着时间变化，可以诱导纳米颗粒/蛋白质复合物的可逆组装与分解（Figure 3）。溶液的pH值是由10 mM氢氧化钠和10 mM盐酸溶液滴定来调控的。与之前展示的结果类似，纳米颗粒/蛋白质复合物在酸性条件下保持稳定，在pH值为5-9时聚集，高于9时会分解。将该过程逆转，从pH高于9的时候开始也可以得到一样的结果。这个循环可以随着时间重复，并且在改变因素为离子强度时也有类似的响应。这些结果表明，该材料具有动态灵敏度，可以在时空上对其行为进行控制。

将蛋白质与纳米颗粒的比值增大，我们除了固体状的团簇还可以得到将功能化的磁性纳米颗粒整合到蛋白质富集相中的圆形液滴，并通过光学显微镜、SEM和冷冻电镜观察到了这一现象（Figure 4A，B和SI）。这些复合液滴可以作为合成的“隔间”，在内部浓缩蛋白质和纳米颗粒，并表现出多种功能，包括对外界磁场和溶液条件的敏感性，酶活性和无机纳米颗粒的催化活性。

铁纳米颗粒对磁场的响应使得在空间中调控复合液滴的形态成为可能。在磁场作用与LCDs的吸引相互作用力相结合下，作者观察到了磁性偶极的排列和超分子结构的形成，比如在高蛋白质/纳米颗粒摩尔比下，复合液滴会形成线性链（Figure 4C和SI）；在低蛋白质/摩尔比下，会形成固体状的小纤维（详见SI）。在第一种情况下，液滴的粘度和纳米颗粒在液滴表面的吸附会减少在裸露的嵌合蛋白的液相分离中观察到的液滴-液滴结合。与其他蛋白质-纳米颗粒体系相比，该复合体系在pH值和离子强度改变时是动态可逆的。作者发现，没有功能化的纳米粒子溶液中没有形成任何的超分子结构，在同样的磁场几天后还是保持分散的。这表明，LCD蛋白质诱导的相互作用是形成复合“隔间”的必备条件。

这些复合“隔间”的一个有趣性质是可以将各个组分的催化活性共定位，从而产生开放的多功能化学酶微反应器（Figure 4D，E）。作者使用荧光显微镜检测了磷酸转移酶AK催化腺嘌呤核苷酸相互转化的活性，并观察到液滴链局部集中了酶的活性（Figure 4D）。同样，作者还通过监测过氧化氢的还原反应来测试铁纳米颗粒的类过氧化物酶催化活性（Figure 4E）。这个反应被广泛的应用在定量检测生物分子的浓度，诊断并产生功能性生物传感器。例如，体液中的过氧化氢的水平是验证和氧化应激的重要生物标志。作者通过检测由铁纳米颗粒催化的Amplex Red转化产生的荧光信号，来量化复合液滴周围环境中过氧化氢的存在（Figure 4E）。即使作者在这里只说明了两个特定反应，这个策略还有可能探究区室化如何影响杂交化学酶级联反应，在环境修复和抗菌剂等重要领域中进行应用。

总结

苏黎世联邦理工学院的Parlo Arosio教授团队报道了一个功能化无机纳米颗粒的策略，该策略将与细胞中无膜区室形成相关的生物蛋白中的内在无序序列修饰在纳米颗粒的表面，生成的蛋白质-纳米颗粒材料具有可控的自组装性质，对pH值和离子强度均具有响应。作者还展示了这个策略可以在时间和空间上控制多种功能，既可以产生多功能材料，还可以生成开放的微反应器进行化学反应，并且可以检测周围环境中分子的存在。作为原理的验证，作者合成了杂交生物无机材料，可以形成反应性线性液滴链，具有杂交酶活性和化学催化活性。他们的工作向合成对不同刺激做出反应的多功能适应性生物无机体系迈出了重要的一步，并在异质生物催化，生物传感和纳米药物中有广泛的应用前景。

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