研究论文介绍

中科院吴海臣研究员课题组Anal. Chem.:一石三鸟,同时感测多种癌症生物标记物的DNA纳米探针

本文作者:海猫

导读

血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属肽酶9(MMP-9)都是肿瘤血管生成的关键生物标记物,确定这两种生物标记物的过表达将为研究肿瘤生长和转移提供有价值的信息,但同时对它们定量仍是一件难事。近日,中科院的吴海臣研究组在分析化学杂志上发表论文,报道了一种基于DNA三链的纳米探针,使用α-溶血素纳米孔可以同时定量VEGF和MMP-9。在探针结构中,DNA适配体用作三联分子信标环以结合VEGF,修饰短肽的寡核苷酸用来识别MMP-9。DNA探针产生的特征性电流事件既实现了对他们的同时定量,也可以反映环境pH值。

Simultaneous Sensing of Multiple Cancer Biomarkers by a Single DNA Nanoprobe in a Nanopore

Bingyuan Guo, Peng Song, Ke Zhou, Lei Liu, and Hai-Chen Wu

Anal. Chem. ASAP DOI: 10.1021/acs.analchem.0c01909

正文

肿瘤转移会导致癌症致死率显著增加,并大大降低了治愈性治疗。从初期的肿瘤细胞发展到晚期肿瘤往往需要数年的时间,因此在肿瘤长大与转移之前,有机会检测癌症生物标记物,如病理器官和细胞分泌的特定蛋白。然而,早期肿瘤释放的生物标记物的浓度通常太低导致无法检测,其次,复杂疾病的可靠诊断,往往需要对同一样品的多种痕量生物标记物同时检测。

肿瘤转移的关键条件之一是新血管网络的生长。血管新生是从先前存在的血管中形成新血管的生理过程,也是肿瘤从无害细胞簇转变为威胁生命的恶性肿瘤的根本步骤。因此,在过去的几十年中,血管生成已经成为癌症治疗的重要靶点之一。在调节血管生成的各种因素中,血管内皮生长因子vascular endothelial growth factor (VEGF)和基质金属肽酶matrix metallopeptidases (MMPs)是两个最重要的刺激因子家族。VEGF也被称为血管通透性因子(VPF),可增强血管通透性并促进新血管的生长。MMPs是锌依赖性内肽酶,负责细胞外基质的降解。VEGF和MMP-9参与了多种癌症,但在不同的癌变过程中起着不同的作用。因此同时测定VEGF和MMP-9可以预测肿瘤的恶化状况与转移。然而迄今为止,常规免疫染色或荧光成像还无法实现对它们的同时检测。

除了血管生成因子之外,肿瘤微环境中的pH值也是癌症的另一个关键指标。肿瘤细胞中会显著的生成H+,但细胞本身会维持一个中性至偏碱性的细胞内pH值7.0-7.2,主要的酸负荷在细胞外空间。然而精确测量肿瘤微环境的局部pH值并非易事,尽管已经开发出多种方法来在体内测量pH值,但仍然需要一种简便快捷的评估肿瘤酸度的方法。

纳米孔传感技术在1990年代末期逐渐兴起,成为了一种功能强大且无标记的单分子技术,当分析物与纳米孔结合时,监测通过纳米孔的离子流的变化,以及通过对平均停留时间和电流幅度变化的联合分析,可以识别分析物,根据结合的频率来计算其扩散浓度。这种简单的技术已经在多种研究领域有了广泛的应用,但是对于多组分混合物来说,利用纳米孔技术同时检测多种分析物仍然具有挑战性。在本研究中,作者使用由三联信号分子信标triplexforming molecular beacon (tMB)结构和宿主客体修饰的DNA肽杂合体组成的模块化DNA纳米探针来量化与血管新生相关的因子VEGF、MMP-9和微环境pH(Figure 1)。引入DNA适配体作为tMB的环来结合靶标,DNA肽杂合体上的苯丙氨酸-葫芦[7]脲(CB[7])复合物产生电流信号,并且tMB茎中的偶氮苯可以进行光异构化以便进行其他操作。作者证明了该DNA纳米探针可以通过α-溶血素(αHL)纳米孔同时测量VEGF、MMP-9和溶液pH值,为癌症诊断提供行之有效的方法。

该基于DNA的tMB纳米探针高度模块化,集成了三个不同的功能(Figure 1)。

第一个功能是用于与传感目标特异性相互作用的识别功能。tMB由一个三链的分子信标(tfMB)和一个寡核苷酸(sfO)组成,tfMB的环是VEGF121的适配体,sfO是一个在其5’端用短肽修饰的20聚DNA,通过Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对与tfMB杂交。FGPLGLK肽(F pep)包含一个MMP-9的切割位点,与葫芦[7]脲(CB[7])形成宿主-客体复合物。因此,识别功能由tfMB环和sfO多肽同时实现。

第二个功能是报告,探针可以产生不同的电流信号进行定量测量,与VEGF121结合之后,tMB将被打开,sfO将会释放。在不存在MMP-9的情况下,sfO会通过α溶血素(αHL)纳米孔进行易位,由于F pep⊂CB[7]的形成而产生特征性的电流信号。当存在MMP-9时,F pep会被切割,从而可以观察到单链DNA的存在。另外,DNA-F pep⊂CB[7]产生的电流信号具有pH依赖性,可以精确反映环境的pH值。

第三个功能是为了定量MMP-9而对环进行的修饰。在不存在VEGF121的情况下,tMB的环将不会打开,sfO将不会释放。在这种情况下,在可以通过光照改变茎中偶氮苯的构型来主动控制环的打开。

首先,作者使用该纳米探针来进行VEGF121的定量。作者使用三种不同茎长的tMB纳米探针对探针结构进行了优化。对照实验显示,8聚和10聚tMB纳米探针在单通道条件下都很稳定,但是VEGF121传感实验表明10聚tMB在VEGF结合后过于稳定。因此选择8聚的tMB用于优化之后的传感性能。与VEGF121结合后,tMB纳米探针的环被打开,sfO被释放。然后,DNA-F pep⊂CB[7]通过αHL的易位产生具有特征性的电流信号,即产生I型和II型事件,这也是传感应用的关键(Figure 2)。I型事件代表DNA杂交的捕获、解离与易位,以及αHL纳米孔内的CB[7]振荡,II型事件代表在αHL纳米孔边缘的DNA杂交解离,而没有之后的易位。值得一提的是,tMB纳米探针也可以进入αHL并诱发明显不同于特征事件的电流信号。

为了量化VEGF121,作者建立了在tMB纳米探针存在时,特征性事件频率(fsig=fI+fII)与不同浓度的VEGF121的标准工作曲线(Figure 3a,品红色)。可以看出,fsig与VEGF121浓度呈准线性关系,检测限为0.1 nM左右。该值与其他检测VEGF121的文献值相当。此外,DNA-F pep⊂CB[7]产生的电流特征对pH敏感。作者构建了fI/(fI+fII)-pH曲线,发现它们在pH值为4.0-8.0范围内呈线性关系(Figure 3a,蓝色)。作者还测试了tMB纳米探针的选择性(Figure 3b),发现其选择性很好。

Figure 3. Independent quantitative measurements of VEGF121, MMP-9, and solution pH by the tMB nanoprobe

接下来,作者用tMB纳米探针进行了MMP-9的定量分析。MMP-9可以催化DNA-F pep杂合体的裂解,但无法打开探针的环茎结构。由短肽丢失引起的电流信号的变化很小,不适合进行定量分析。受之前用偶氮苯来控制DNA三链体形成的研究工作的启发,作者在茎的中部引入了一个偶氮苯基团来操纵tMB纳米探针的打开。在365 nm紫外光照射下,由圆二色谱和单通道记录检测发现,几乎所有tMB结构都裂解了。当经过MMP-9和UV处理的tMB纳米探针通过纳米孔时,作者观察到了sfO引起的ssDNA易位事件以及tfMB产生的一种二级电流事件,他们都由裂解反应产生,因此可用于定量MMP-9。MMP-9的浓度与fssDNA-UV的标准工作曲线由Figure 3c所示。结果表明,对MMP-9的检测限约为10 pM,是有史以来检测MMP-9的最低值。作者也测试了探针对MMP-9的选择性(Figure 3d),发现其选择性也很好。

实际上,VEGF121和MMP-9很有可能在同一样品中共存。因此作者评估了tMB纳米探针对VEGF121和MMP-9的同时定量(Figure 4)。他们先用tMB纳米探针单独与VEGF121培育,然后再加入MMP-9。当只有VEGF121在溶液中存在时,tMB纳米探针分解后释放了sfO,产生了相应的电流变化信号。当MMP-9加入溶液中时,很多电流信号被转化为ssDNA事件。这种明显的电流变化表明VEGF121和MMP-9是按顺序加入的。这两种电流现象应该结合起来以定量VEGF121,即fVEGF = fsig+fssDNA。作者在存在MMP-9(10 nM)的情况下对VEGF121进行定量,发现MMP-9的存在不干扰VEGF121的定量(Figure 4a)。改变MMP-9的浓度,结论依然成立(Figure 4c,品红色)。

当VEGF121和MMP-9同时在溶液中存在时,对MMP-9的定量仍旧依赖于UV的照射来完全打开tMB结构,因为VEGF121的量还不足以打开所有的纳米探针。作者认为,无论VEGF121是否存在,MMP-9的定量都是由fssDNA-UV来决定的。在VEGF121(10 nM)的存在下,作者对MMP-9进行了定量(Figure 4b),结果表明,VEGF121的存在对其影响很小。作者也改变了VEGF121的浓度(Figure 4c),结论仍然成立。

作者也在二者同时存在下,探索了pH值的测量。在pH=5.0的情况下,MMP-9对tMB纳米探针的催化裂解过程中,电流信号不会随酶促反应而变化(Figure 4d,红色)。在pH 4.0-8.0的范围中,二者同时存在的情况下,fI/(fI+fII)-pH曲线与在缓冲液中测定的工作曲线基本一致(Figure 4d,蓝色)。

Figure 4. Simultaneous quantification of VEGF121, MMP-9, and environmental pH

最后,为了探索该策略的实用性,作者在尿液中模拟真实生理样品,对VEGF121和MMP-9进行了定量。结果表明,无论这两种蛋白质的比例如何,定量的结果都和独立的测量结果比较接近(Figure 5)。相比较下,对MMP-9的检测会比VEGF121更容易被尿液中的杂质所影响,可能因为尿液中有些杂质对电流的影响会和ssDNA事件相似,不过影响较小。

Figure 5. Simultaneous quantification of VEGF 121 and MMP-9 in spiked urine samples

结语

中科院的吴海臣研究组报道了一种新的检测系统,使用一种tMB结构,在纳米孔中实现了对一些血管生成因子与环境的pH同时检测。无论是对VEGF、MMP-9的分开检测,还是在他们同时存在的情况下分别进行定量,结果都没有很大的影响。VEGF和MMP-9的相继加入会产生不同的电流事件。该方法比较新颖,可以为非侵入式诊断肿瘤血管生成和转移提供一种途径。相信经过后续的研究,纳米孔可以在疾病机理诊断中发挥更多的作用。

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