实验技巧

LC-MS方法在药物代谢研究中应用的优缺点

随着中国传统医药体系现代化与国际化进程地不断深入,中药研究工作者因此面临着越来越多的机遇与挑战。中药的成分极具复杂性,其代谢后的成分量少而种类多,因而需要用分离能力与结构鉴定能力兼具的分析工具对药物代谢后的产物进行分析。液相色谱-质谱联用方法(LC-MS)的日趋成熟加快药物代谢研究步伐。本文综述了LC-MS方法在药物代谢研究应用中的优缺点。

1 利用LC-MS方法在药物代谢中的研究优势[1]

LC-MS方法中液相部分与其他方法如HPLC-UV或HPLC-ELSD差距不大,液质联用方法的优势主要体现在于质谱上。质谱因其有高灵敏度、专属性等特点组合上液相高的分离效率很大程度上方便了对药物代谢方面的研究。

1.1 提高了对目标物的分析灵敏度和专属性

液质联用中以质谱仪作为检测系统,以特定选择离子作为信号记录对象,使其对目标物的响应更高,有更低的检出限,而特定检测离子选择条件,使得其对该目标物的检测专属性更强。利用LC-MS不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的分离纯化工作,而且能分离鉴定以往难于辨识的痕量的药物代谢物,可以迅速、方便地应用于研究[2]。杨宜华[3]采用LC-MS法测定白花蛇舌草中主要有效成分齐墩果酸与熊果酸的含量,通过对照品及样品LC图和对照品及样品离子流图从而得出含量测定结果,得出了两种有机酸的平均加样回收率分别为98.87%和100.78%(Fig 1),从而进一步证实了液质联用的高灵敏度及良好的重现性。果德安课题组利用LC/UV-DAD/ESI-MS对大鼠灌胃降香总黄酮的体内代谢情况进行了初步研究[4],对大鼠血清、尿液和组织样品进行了快速、准确的定性分析,因此可以得出此技术能很好的帮我们解决在药物代谢研究中遇到的灵敏度低、专属性差的问题。

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Fig 1 白花蛇舌草中主要有效成分齐墩果酸与熊果酸的含量.

1.2 极大提高了分析效率

质谱仪对碎片离子的筛选,使得一部分极性相当的物质可以被轻易的区别开来,使得分析人员在分离极性相似的物质的时候,可以相同色谱条件条件,在分离度不佳的情况下分析出在高效液相色谱仪中无法祛除干扰的样品,极大提高了分析效率。同时,随着仪器的不断改进,目前仪器已经实现了高度自动化,这在很大程度上减轻了分析人员的工作量,提高了分析工作的效率[5]。例如对生物样品中药物浓度的LC/MS分析,我们通常采用三重四极杆串联质谱的选择反应监测(SRM)方式,该方式的特点为:在第一级质谱选定准分子离子,第二级质谱选定某一碎片离子,通过两级质谱分析使最终结果的化学噪音降低,得到非常高的分析选择性。史向国[6]等用LC-MS法鉴定抗生素新药必特螺旋霉素中的多组分,实验结果得到10种螺旋霉素类衍生物,并推断出化学结构,通过与对照品的色谱、质谱对比得到验证,通过此实验得出了LC-MS法是适合快速分析复杂大环内酯类抗生素的分析方法之一的结论。

1.3 较为准确地鉴定化合物的结构,定性定量结果可靠

目前应用较多的Q-TOF能提供精确质量数,通过建立精确质量数据库(包括化合物的名称、分子式、精确分子量及保留时间等信息),与精确的分子质量数的匹配得到化合物的化学式,使化合物的鉴定更加准确;即使缺乏对照品也能通过库检索快速准确地进行定性检测[7]。马康[8]等利用HPLC/ESI、LC-Q-TOF/MS、ITLC-Q-TOF/MS、TOF/MS对异羟基洋地黄毒苷(地高辛)和洋地黄毒苷对照品进行分析,总结了两者的多级质谱裂解规律,研究质谱碎片裂解途径,建立了地高辛原料药的液相色谱分离条件及质谱分析条件。根据HPLC/ESI、LC-Q-TOF MS、ITLC-Q-TOF MS、TOF/MS提供的高准确的多级碎片信息并结合相关文献,准确鉴别了地高辛中的12种微量有关物质,并首次识别2种新的有关物质(Fig 2)。侯鹏飞[9]等采用LC-ESI-TOF/MS分析延胡索中的生物碱成分,根据所测得的各组分分子离子峰的m/z值并查阅文献,鉴定出了YHS中的11个化学成分,分别为四氢非洲防己碱、原托品碱、延胡索碱、黄连碱、延胡索乙素、非洲防己碱、四氢黄连碱、四氢小檗碱、小檗碱、巴马亭、脱氢紫堇碱(Fig 3)。

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Fig 2 高辛原料药的总离子流图.

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Fig 3 延胡索以及水提液的总离子流图.

2 缺点

LC-MS将HPLC的高分离效能与MS的强大结构测定功能组合起来为中药化学成分的快速分析提供了一个重要的新技术,极大程度上推动了中药的现代化进程[15]。虽然LC-MS技术在中药研究中具有可观的应用潜力,但其普遍性远不及HPLC或GC/MS,究其原因如下:

2.1 价格昂贵

单个液相色谱或者质谱价值不菲,如果要搭建液质联用平台则需要有相当大的支出。这给很多科研机构、事业单位带来了不小的压力,很多单位因为缺少经费而不得不放弃使用液质联用技术。

2.2 维修费用高

仪器使用过程中难免会有损伤,在仪器的后期保养过程中需要花费较多的保养费用;除此之外,仪器中小部件多,一旦损坏替换所需要的费用也较高。

2.3 检测灵敏度存在差异

另外,虽然联用技术在灵敏度、检测限方面相对于别的仪器而言有较大的优势,但是对于不同的药物分子,随着离子化程度的难易,LC/MS/MS检测灵敏度存在巨大差异。目前,对有机碱性药物的灵敏度最高,定量下限一般可达ng/ml或更低、对酸性、中性药物的灵敏度依次降低、对烃类化合物则没有信号响应;除此之外,利用LC/MS/MS进行分析可能受到溶液中其他离子的影响,特别是离子抑制效应;另外,药物分子之间或与其他离子形成的加合物也会对测试结果产生影响[10]

总结与展望

虽然LC-MS方法存在着不足,但是相对于目前已有的分析方法而言在药物代谢研究方面有较大的优势,该方法的成熟与发展必将推动中药的现代化的研究不断深入,加快中药国际化的步伐。可以相信,LC-MS技术将在未来数年内会广泛应用于中药领域,尤其是中药代谢研究中。

参考文献

  1. 易啸, 张开莲.色谱-质谱联用在药物代谢动力学研究中的应用.大家健康。2014,(08):411.
  2. 吕春艳, 张兰桐. 液-质联用技术在中药与天然产物代谢研究中的应用. 中国药学杂志. 2006, (04): 241-244.
  3. 杨宜华, 陈玉祥. 液质联用法测定白花蛇舌草齐墩果酸与熊果酸含量. 医药导报. 2008, (05): 589-591.
  4. 刘荣霞, 果德安, 叶敏, 王巧, 张金兰. 液质联用技术(LC/MS)在中药现代研究中的应用. 世界科学技术. 2005, (05): 33-40.
  5. 尹显贵. 液相色谱-质谱/串联质谱联用技术及其在药物分析中的应用. 天津药学. 2005, (03): 51-53.
  6. 6 史向国, 钟大放. 液相色谱-质谱联用法鉴定必特螺旋霉素中多组分. 质谱学报. 2003, (04): 460-463.
  7. 彭耀文, 申兰慧, 王丽, 金舒, 金坚, 杨敏智. 液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用技术在药物分析中的应用. 中南药学. 2015, (09): 962-965.
  8. 马康, 苏福海, 董静, 赵敏, 姚巍. 高效液相色谱/电喷雾-离子阱-飞行时间质谱法鉴定地高辛中的微量有关物质. 中国药学杂志. 2012, (08): 608-613.
  9. 侯鹏飞, 宿树兰, 段金廒, 刘汉清. 液质联用技术分析延胡索中的生物碱类成分. 中国医药导报. 2008,(11): 48-49.
  10. 钟大放.液相色谱-质谱联用法在药物研究中的应用.世界科学技术-中医药现代化药物分析技术.2003,(5):44-47.

 

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