作者：石油醚

引言

近日， B Merck & Co., Inc的科学家开发了一条四步简洁高效合成 MK-2118的路线，以提供临床样品。该路线以进化型 ERED 催化的对映选择性还原为 API 步骤，精准构建关键 α-甲基立体中心。仅两轮定向进化，即获得性能提升达 10 倍的工艺变体，在最终还原中实现高转化率、>99% ee 及优异的体积生产力。全程采用廉价易得原料，关键烯烃中间体通过丙酮酸钠介导的 HWE 反应高效制备（Z/E = 200:1），确保酶反应底物几何纯度。最终，该化学–酶法整合工艺以 40% 总收率、99.7% ee 和 99.78% 纯度交付高品质的MK-2118（>10 kg）。

A Chemoenzymatic Synthesis of STING Agonist MK-2118

Chihui An,* Grant S. Murphy, Jeffrey C. Moore, Erik D. Guetschow, Yonggang Chen, Lushi Tan, Nicholas M. Marshall, Mark A. Huffman, Alexey A. Makarov, Margie Borra-Garske, Oscar Alvizo, Chengqian Xiao, Yi Zhang, and Jianjun Duan

Org. Process Res. Dev. 2026. DOI : 10.1021/acs.oprd.5c00448

正文

酶催化可高效合成多种活性药物成分（API）。相比传统化学法，酶反应步骤更少，且可用低毒、水溶性试剂替代有毒有机溶剂。此外，酶催化往往以优异的化学、对映和非对映选择性获得所需产物，远超其他合成方法，助力制药企业实现绿色、可持续的工艺目标。然而，要充分发挥生物催化的潜力，需通过定向进化持续优化酶的稳定性、活性和选择性。尽管蛋白质工程能力强大，但开发满足生产要求的定制化酶通常耗时耗力。商业生产工艺有数年开发周期，而临床供药流程往往仅剩数月——这一紧迫时限使酶进化难以应用，目前临床阶段的生物催化基本依赖现成的商业化酶。

为拓展生物催化在药物研发全流程中的应用，科学家聚焦于早期临床项目，优化口服STING激动剂MK-2118的临床供药路线。其中，MK-2118具备口服优势，可降低治疗成本、提升患者可及性。其首次人体（FIH）试验所用原料药采用铜催化的Blaise 酮合成法，依赖市售手性有机锌试剂（Scheme 1）。该路线虽如期完成，但试剂价格高、供货周期长、稳定性差，难以支撑后续多批次临床供应，构成显著供应链风险。为保障后续临床交付，科学家将重心转向构建α-甲基立体中心的替代策略：前期尝试的钌催化不对称氢化虽规避了手性锌试剂，但收率与对映选择性偏低，且需高压氢气设备，限制了工厂适用性。最终，Merck & Co., Inc的化学家们选用工程化enoate-还原酶（ERED），成功开发了以一条4步化学酶法合成MK-2118（>10 kg）精简路线，从而省去特种设备，降低成本，显著简化供应链（Scheme 1）。

基于MK-2118的结构，作者对其进行了逆合成分析（Scheme 2）。即以5和4的环化反应构建苯并噻吩骨架3，3通过wittig 反应获得关键中间体2，2经工程化enoate-还原酶（ERED）还原双键即可完成MK-2118的合成。

首先，作者对（E）-2 和（Z）-2 在 96 种市售 ERED 中进行筛选。初步结果表明，两种烯烃表现出显著差异的活性与对映选择性，与文献报道一致。多种高活性、立体互补的 ERED 可将（Z）-2 高选择性地转化为 MK-2118 的任一对映体。而（E）-2 在全部 ERED 中的反应性微弱（转化率 <10%），且产物对映选择性差或完全生成非目标异构体（Table 1）。进一步结果表明：ERED-P1C5 的效果最佳：仅对（Z）-2 转化率达 63%，且对映选择性为98.2%。在 Z/E 混合物中，（E）-2 不反应，但随其比例升高，（Z）-2 的转化率下降，表明（E）-2 具有竞争性抑制作用。鉴于（Z）-2 在该酶上兼具良好活性与卓越立体控制，作者选定 ERED-P1C5 进行首轮定向进化（Rd1BB）。

REDs 以 FMNH₂ 为氢源，通过 1,4-加成还原不饱和底物；黄素辅因子再生则依赖 NADPH。由于 NADPH 成本高昂，需耦合辅因子再生酶实现催化循环。其次，作者对ERED的氢源进行了筛选，即初始筛选采用市售葡萄糖脱氢酶（GDH）或亚磷酸脱氢酶（PDH），但二者均不适用于规模化：GDH 氧化葡萄糖生成葡萄糖酸，导致持续产酸，需在高浓度反应体系中严格控 pH，工程实施难度大；且过量葡萄糖干扰后续产物分离。PDH 氧化亚磷酸盐生成磷酸，无 pH 漂移问题，但在本体系中，当亚磷酸盐浓度达 500 mM 且底物浓度为 50 g/L 时，转化率骤降。为彻底规避上述限制，作者选用酮还原酶（KRED）/2-丙醇（IPA）系统进行 NADPH 再生。IPA 及其氧化副产物丙酮均具高挥发性，可于后处理中轻松去除。经筛选，KRED-P1D3 对（Z）-2 和 MK-2118 无脱靶活性，与 ERED-P1C5 协同催化时，MK-2118 转化率达 91%；仅在高 IPA 浓度下活性略有下降（Scheme 3，Table 2）。

随后，作者在工艺条件（（50 g/L（Z）-2，相对于底物浓度 25%（重量）的酶负载量）下，对ERED-P1C5兼容性进行了研究。初步结果表明：低酶量与高底物浓度的匹配性不足。基于此，为此，作者利用定向进化来寻找符合工艺的酶，目标是提升酶对高底物浓度（≥50 g/L）、低酶载量（≤25 wt%）及高 IPA 浓度的耐受性。其初筛采用快速质谱法（20 s/样），按活性分级；随后以手性 HPLC（3.5 min/样）确认立体选择性。首轮突变库（位点饱和与组合突变）聚焦活性提升，在简化条件下评估：底物 5 g/L、裂解液 10 vol%、无 IPA（Table 3）。最优变体 ERED_Rd2BB（第二轮骨架）在高通量筛选中活性提高 5 倍，并在工艺条件下将 MK-2118 转化率提升至 61%。

接下来，作者将重点放在提升 ERED 的底物与 IPA 耐受性等方面。当（Z）-2 浓度从 5 g/L 升至 25 g/L 时，ERED_Rd2BB 活性下降约 5 倍。然而，其在 25 g/L 下仍具备足够活性，支撑高通量筛选。同样，IPA 浓度升高也导致其活性下降。为排除 KRED-P1D3 对 IPA 敏感的干扰，KRED-P1D3 在 5–25 vol% IPA 中的活性结果稳定，进而证实 ERED_Rd2BB 才是 IPA 耐受性的瓶颈。第二轮进化构建有益突变组合库与位点饱和库，并在 5 vol% IPA、25 g/L（Z）-2 条件下筛选，以同步强化两种耐受性。最优变体在高通量筛选中性能提升 2.0 倍（表 3）。仅经两轮定向进化，作者就成功地将 ERED-P1C5 工程化，使其能够将（Z）-2 以出色的对映选择性获得还原为 MK2118，同时降低酶的负载量（≤25 wt %），并提高对底物和异丙醇的耐受性。

基于此，作者着手开发一条合成 (Z)-2 的简洁路线（Scheme 4）。即以乙硫基乙酸乙酯（4）与 6-溴香草醛（5）在 CuBr/K₂CO₃ 催化下环合构建苯并噻吩骨架，以 78%产率得到酯（3）。随后，LDA 介导3发生 MePO(OMe)₂ 磷酰化，以82%的产率制备膦酸酯（6）。接着，膦酸酯（6）与乙基-2-氧代丙酸乙酯经 Horner–Wadsworth–Emmons（HWE）反应，以良好 Z/E 选择性获得 (Z)-7。最后，(Z)-7在LiOH的作用线脱除酯基，以 84% 收率得目标酸 (Z)-2，但该皂化步骤重现性差：多次重复时 Z/E 比波动剧烈（2:1–10:1）。鉴于进化型 ERED 仅识别 Z-烯烃生成 MK-2118，而当前路线无法保障几何纯度，亟需一条能高保真提供 (Z)-2 的替代合成路径。

尽管 API 步骤以游离酸（Z）-2 为起始原料，进化型 ERED 的实际底物却是其羧酸盐。该生物转化最适 pH 为 7.0，需在加入 ERED 启动不对称还原前，加碱将酸完全去质子化。为此，作者直接采用钠盐 8 作为 ERED 底物，并重构终步合成：以丙酮酸钠与膦酸酯 6 经 HWE 反应一步制得钠盐 8，Z/E 选择性高达 200:1（Scheme 5）。该纯度（200:1）远优于早期使用的（Z）-2（15:1），加之发酵来源酶粉纯度高于摇瓶培养粉，作者预期酶载量与性能将显著提升。实际验证表明：在目标工艺浓度（50 g/L）下，仅需 5 wt% 工艺变体（较前期摇瓶粉的 25 wt%，Table 3），即可以出色的对映选择性实现完全转化。经水相处理与结晶，以 82% 收率、99.7% ee 和 99.78% 纯度获得MK-2118。

结论

综上，Merck & Co., Inc的科学家开发了一条四步简洁高效合成 MK-2118的路线，以提供临床样品。该路线以进化型 ERED 催化的对映选择性还原为 API 步骤，精准构建关键 α-甲基立体中心。仅经两轮定向进化，即获得性能提升达 10 倍的工艺变体，在最终还原中实现高转化率、>99% ee 及优异的体积生产力。全程采用廉价易得原料，关键烯烃中间体通过丙酮酸钠介导的 HWE 反应高效制备（Z/E = 200:1），确保酶反应底物几何纯度。最终，该化学–酶法整合工艺以 40% 总收率、99.7% ee 和 99.78% 纯度交付高品质的MK-2118。

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