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定量PCR(qPCR ; quantitative PCR),实时荧光定量PCR

本文来自Chem-Station日文版 定量PCR(qPCR ; quantitative PCR)、リアルタイムPCR    kanako

翻译投稿 炸鸡 校对 HaoHu

实时荧光定量PCR 利用聚合酶链式反应(PCR)来定量分析待测样品中特定的DNA序列。如果使用该方法,就可以调查靶基因的表达量和样本中病毒基因的含量。因为一般的qPCR是实时定量分析的,所以很多时候,qPCR又称作实时荧光定量PCR。常用的检测方法有绿色环保法(SYBR Green)和TaqMan探针法(TaqMan Probe)两种。

那么实时荧光定量PCR和普通的PCR有什么区别呢?普通的PCR利用DNA扩增反应后DNA单链的重组,只以重组后的DNA双链作为对象;但实时荧光定量PCR则着重于DNA扩增反应中,故得名“实时荧光定量PCR”。qPCR还有一种不是实时测量的方法,即通过电泳分离扩增后的DNA样本进行定量分析。

(请注意,生物相关领域经常看到“RT-PCR”字样,但这并不是“实时荧光定量PCR”的意思,它其实是“反转录”(reverse transcription PCR)的意思。这一点请各位要特别注意。)

1. qPCRSYBR Green法(掺入法)

掺入法是通过向DNA双链中掺入荧光分子来定量分析DNA分子的复制量的。SYBR Green是常用的一种荧光分子。

SYBR Green I的化学构造

下面是SYBR Green法的过程。

  1. 向PCR反应溶液中加入能掺入DNA双链的荧光分子。
  2. DNA开始扩增,荧光分子掺入DNA分子中并发射荧光信号。
  3. 根据发射的荧光信号来定量分析DNA的扩增量。

但这个方法有个缺点:非检测对象的DNA单链也会非特异性地扩增,荧光分子也会掺入其中并发出荧光信号。但是我们下面介绍的TaqMan探针法具有只在目的DNA中发射荧光信号的优点。

2. qPCR: TaqMan Probe法(水解探针法)

TaqMan Probe法是利用FRET(荧光共振能量转移)来定量测定DNA的扩增量。TaqMan探针和Taq DNA聚合酶是两个重要的角色。

  • TaqMan探针: TaqMan探针是一段较短的DNA单链,其上结合有一对引起FRET的荧光分子。为了与靶基因片段配对,将单链DNA的碱基序列设计为与靶基因片段互补的序列。TaqMan探针遇水分解,如果TaqMan探针被水解,就会使一对荧光分子分开,从而不发生FRET。也就是说,只有被淬灭的荧光分子会发出荧光信号。
  • Taq DNA聚合酶:Taq DNA聚合酶不仅能帮助合成DNA还能沿5’-3’方向水解DNA(即具有5’-3’核酸外切酶活性)。这样,DNA扩增的时候TaqMan探针就会被水解掉。

下面是TaqMan探针法的过程。

  1. 向PCR反应溶液中加入TaqMan探针,扩增开始。用Taq DNA聚合酶替换普通的DNA聚合酶。
  2. TaqMan探针和模板DNA配对。
  3. Taq DNA聚合酶在DNA扩增的同时分解TaqMan探针。
  4. FRET荧光分子对相互分离,淬灭的荧光分子发出荧光信号。

TaqMan探针法与SYBR Green法不同,TaqMan探针法由于使用了能与靶遗传基因特异性结合的探针,所以数据更可靠。

3. qPCR的数据分析

我们会由qPCR得到如下的DNA扩增曲线(=荧光强度)。以已知稀释浓度的DNA作为标准样品来定量分析未知的DNA样品。

我们把达到一定增幅量所需的周期数称为Ct值(threshold cycle)。以Ct值为横轴,以标准样本的原始浓度为纵轴,绘制标准曲线图。通过将得到的标准曲线与未知样本的Ct值进行对照,可以求得未知样本扩增后DNA浓度。

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