「Spotlight Research」人工搭建自由基环化酶

化学家专访

「Spotlight Research」人工搭建自由基环化酶

作者：石油醚

本期热点研究，我们邀请到了本文共同第一作者，来自巴塞尔大学的博士生陈栋萍为我们分享。

2024年7月19日， Nature Chemistry在线发表了来自瑞士巴塞尔大学的Thomas R. Ward教授课题组题为「An Evolved Artificial Radical Cyclase Enables the Construction of Bicyclic Terpenoid Scaffolds via an H-Atom Transfer Pathway」的研究论文。基于生物素和链霉亲和素的强亲和力，作者通过在工程化改造的嵌合链霉亲和素中锚定生物素[Co(schiff-base)] 的人造辅因子而构建了人工自由基环化酶（ARCase）。经过计算辅助的蛋白改造以及两轮定向进化获得的最佳突变体可以顺利地催化自由基环化反应，一步合成具有cis-5-6-稠环结构和高对映选择性的双环产物。QM/MM计算以及单晶结构证明突变引入的组氨酸残基与催化中心的钴原子具有配位作用。通过对反应过程的实时监测，揭露了ARCase 成功地催化了一个包含两步反应的级联过程，即钴氢介导的自由基环化和共轭还原反应。此外，ARCase对二烯酮底物的变化表现出较好的耐受性，并且结合化学合成与酶合成策略，可以快速实现萜类化合物中的三环骨架的手性构建，展示了其在复杂萜类化合物甚至药物分子合成中的潜力。

“An Evolved Artificial Radical Cyclase Enables the Construction of Bicyclic Terpenoid Scaffolds via an H-Atom Transfer Pathway.

Dongping Chen‡, Xiang Zhang‡ Anastassia Andreevna Vorobieva, Ryo Tachibana, Alina Stein, Roman P. Jakob, Zhi Zou, Damian Alexander Graf, Ang Li, Timm Maier, Bruno E. Correia*, Thomas R. Ward*

Nat.Chem. 2024. Doi: 10.1038/s41557-024-01562-5”

Q1. 请对“An Evolved Artificial Radical Cyclase Enables the Construction of Bicyclic Terpenoid Scaffolds via an H-Atom Transfer Pathway”作一个简单介绍。

自然界利用天然萜类环化酶通过阳离子机制可以产生复杂的萜类化合物，但其他的反应途径比如自由基环化途径却尚未得到充分地探索。金属催化的氢原子转移（M-HAT）反应可以高效地实现非活化烯烃的氢官能团化，进而为从链状多烯前体到多环萜类骨架提供了一种有效的转化策略。人工金属酶是一种可以将均相催化体系高效地引入到基因可控的蛋白质骨架中的催化模式，为将非天然的 M-HAT 反应引入进自然界的生物催化提供了一个可靠的策略。在该工作中，依赖于生物素和链霉亲和素的强亲和力，我们报道了基于M-HAT 反应的人工自由基环化酶（ARCase）的设计和构建。我们首先设计并合成了多个生物素连接的、Salophen作为配体的钴金属化合物，并通过条件优化获得了表现最佳的金属化合物作为ARCase的人工辅因子。我们进一步与瑞士洛桑理工学院的Correia课题组合作，设计并构建了嵌合型的链霉亲和素的蛋白骨架库，通过在活化中心上方引入长度不一、形状各异的环片段来增强其密闭性。借助基于细胞裂解液的快速筛选和纯化蛋白的进一步验证，我们成功获得了活性和选择性均进一步提高的嵌合链霉亲和素ARCase的蛋白骨架，并发现该骨架成功地嵌入了16个氨基酸序列的、含α螺旋结构的环片段。经过两轮蛋白改造，我们发现了一个含双突变体的ARCase可以构建具有cis-5-6-稠环结构的双环环化产物，并且选择性高达 97% ee。通过QM/MM计算以及单晶结构解析，我们确认了突变引入的组氨酸残基与催化中心的钴原子的配位作用。我们推测该配位作用不仅可以进一步稳定人工辅因子在蛋白环境中的构象，而且还可以增强其的电子云密度，从而极大地提高了M-HAT反应活性。进一步通过对反应过程的实时监测，我们发现ARCase 成功地催化了一个含两步反应的级联过程，即钴氢介导的自由基环化和共轭还原反应。在底物拓展中， ARCase对二烯酮底物的变化表现出较好的耐受性，并且结合化学合成与酶合成策略，可以快速实现萜类化合物中的三环骨架的手性构建，展示了其在复杂萜类化合物甚至药物分子合成中的潜力。

Q2.在研究的时候遇到过怎样的困难呢？又是怎样克服的呢？

当我们发现双突变体能够得到不错的选择性时，我们进行了一系列的优化，然而收率还是不能提高。为此，我们苦恼了一段时间。我们尝试从生物催化的角度思考，是不是可能存在产物进一步转化。为此，我们把消旋的标准产物投入到反应体系中，发现了产物被进一步消耗，并且出现动力学拆分的现象。因此，我们把可能生成的副产物通过化学方法合成出来，与酶催化反应体系进行比较，最终确认是目标产物的烯酮官能团会被进一步还原，而对反应过程的实时监测也进一步验证了我们的猜想。通过对反应结果的思考和研究，我们顺利地揭露了ARCase可以实现基于M-HAT的含两步反应的级联过程的有趣现象。

Q3.本次研究主体，有没有什么让您感觉特别辛苦和烧脑呢？

我们的工作从开始到结束，处在组里青黄不接的过渡期，尤其是生物方面的技能急需有人能够推动课题前进，为此我也沮丧了一段时间，这也逼迫我换一个角度思考，学习并掌握推动这个课题前进所需要的生物知识。

Q4. 将来想继续研究化学的哪个方向呢？

目前，博士即将毕业。希望以后能够从事人工金属酶，蛋白设计，合成生物学的相关工作。

Q5. 最后，有什么想对各位读者说的吗？

科学研究是一个需要不断试错、不断探索的旅途，大部分时间并不一定能够如己所愿，但贵在坚持，我们可以从这个旅途中得到多个维度的训练，而这些经验教训对以后的研究工作来说是一个宝贵的财富。我很感激在这个项目的探索过程中，我的导师Prof. Thomas R. Ward对我的耐心指导，无条件地支持和极大的鼓励，促使我快速成长并积极推动课题前进。很感激我们团队里的每一个成员的努力，他们也为这份工作的发表做出了巨大贡献。这份工作将会成为我的个人成长和职业发展中非常重要的经历。