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蛋白质定量——Lowry 法

译自Chem-Station网站日本版 原文链接:タンパク質の定量法―ローリー法 Protein Quantification – Lowry Method

翻译:炸鸡

原理

Lowry蛋白质测定法是用来定量确定溶液中蛋白质浓度的比色法,是古典比色法(Biuret test)的改良版。

在碱性条件下向蛋白质溶液中加入Cu2+,Cu2+被肽键还原成Cu+,Cu+还原Folin-Ciocalteu试剂中的仲钼酸-钨配合物,还原产物呈蓝色并在770nm处有吸收,可以通过测定吸光度来计算蛋白质的含量。

优点

  • 测定范围扩大到2-2 mg/mL,比古典比色法(Biuret test)的测量范围要广
  • 操作简单

缺点

  • 反应耗时长
  • 易受表面活性剂,螯合物和硫醇还原剂的影响

操作流程

试剂调配

A溶液

Na2CO3(20 g)、NaOH(4 g)用超纯水定容至1L。调配好的溶液可在室温温度到冷藏温度之间保存数月。

B溶液

Cu2SO4-5H2O(1 g)、酒石酸钾钠(2 g)用超纯水定容至200mL。调配好的溶液可在室温温度到冷藏温度之间保存数月。

Folin-Ciocâlteu试剂

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步骤

  1. 将A溶液和B溶液按体积比50꞉1的比例混合(随用随配)
  2. 向待测样品加入步骤里混合好的溶液(100 μL样品对应1mL的混合溶液),并用高速搅拌器搅拌
  3. 30℃下静置10分钟
  4. 加入100μL的Folin试剂,高速搅拌器搅拌
  5. 30℃下静置30分钟
  6. 测定在770nm处的吸光度
  7. 以BSA为标准样品制备稀释样品和做出校准曲线,并在此基础上对浓度进行量化

参考文献

  1. ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき2018, 1, 2. [PDF]
  2. “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M.  Enzymol.1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
  3. “Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent” Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. l.; Randall, R. J.   Biol. Chem.1951, 193, 265-275. doi:10.1016/S0021-9258(19)52451-6

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