实验技巧

蛋白质定量-布拉德福蛋白质定量法Bradford Protein Assay

译自Chem-Station网站日本版 原文链接:タンパク質の定量法―ブラッドフォード法 Protein Quantification – Bradford Protein Assay

翻译:炸鸡

原理

布拉德福蛋白质定量法Bradford Protein Assary与BCA法并列为最常使用的蛋白质浓度定量法。

原理是考马斯亮蓝(CBB) G-250这种色素会与蛋白质的碱性且属于芳香族的氨基酸的侧链相互作用,考马斯亮蓝的最大吸收峰会从(Metachromazy 反应)465 nm变为595 nm。

优点

  • 测定范围在01-2 mg/mL、灵敏度高
  • 操作十分简单迅速
  • 受螯合剂和还原剂的影响很小

缺点

  • 易受界面活性剂的影响
  • 因为反应液是酸性的,含有脂质的样品容易产生沉淀
  • 结果会因蛋白质种类而变化
  • 色素会被吸附到玻璃或石英制的吸收池上

操作步骤

Bradford试剂各个试剂公司都有售卖,但是按照下面的方法也可以自制。

Bradford试剂的调制法

将考马斯亮蓝CBB G-250 (200 mg)加入乙醇(100 mL)中搅拌均匀使其充分溶解。然后加入85%的磷酸(200 mL)。然后用超纯水定容至2L。溶液中含有的蓝色不溶物用脱脂棉或滤纸过滤。试剂放入冰箱内遮光保存。

步骤

  1. 向100μL样品中加入1ml的Bradford试剂,用高速搅拌器搅拌均匀。
  2. 5~30分钟内测量混合溶液在595 nm处的吸光度。
  3. 以BSA(牛血清白蛋白)作为标准品制作稀释曲线。

如果待测样品是膜蛋白质的话,建议加入1M NaOH水溶液以方便溶解[2]

参考文献

  1. ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき2018, 1, 2. [PDF]
  2. “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M.  Enzymol.1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
  3. “Comparison of five methods for determination fo total plasma protein concentration” Okutucu, B.; Dincer, A.; Habib, Ö.; Zihnioglu, F. J.  Biophys. Methods2007, 70, 709. doi:10.1016/j.jbbm.2007.05.009
  4. “A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding” Bradford, M. M.  Biochem. 1976, 72 (1–2), 248–254. doi:10.1006/abio.1976.9999
  5. ”Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies” Zor, T.; Selinger, Z. Anal Biochem.1996, 236, 302. doi:1006/abio.1996.0171

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