利用DNA滚环扩增反应对细胞表面多糖进行标记成像

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利用DNA滚环扩增反应对细胞表面多糖进行标记成像

（本文投稿作者 桃花妖）

在2016年7月，山东大学的李福川教授在Chemical Science上发表了关于细胞表面糖蛋白成像的研究成果，研究很有新意，也颇有发展前景，下面就对这项工作进行介绍。

糖蛋白的标记

蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰过程，对糖蛋白进行标记，有助于理解众多的生理过程和病理过程。特别是在细胞表面的糖蛋白，更是参与细胞通讯，肿瘤发生等过程。由于多糖本身不含可视化基团，利用荧光基团对进行多糖的标记成为一个重要的研究方法。

在一系列对糖进行标记的方法中，利用叠氮糖进行标记是一类被广泛研究的策略。该方法先合成含有叠氮基团的糖类（唾液酸）衍生物，之后使其转运到膜蛋白上，通过偶联荧光基团或其他可探测基团使这一复合物可以检测到。

图 1 叠氮糖标记

叠氮糖的毒性

叠氮糖作为重要的化合物在蛋白质标记和细胞成像中已经广泛应用，但是叠氮糖是具有细胞毒性的。使用三种不同的叠氮糖(Ac₄GlcNAz, Ac₄ManNAz, Ac₄GalNAz)对B16细胞进行培养，在不同浓度下均影响到了细胞的生长。因此，在进行细胞成像的使用时，需要控制叠氮糖的浓度。

图 2 叠氮糖的细胞毒性

对于一些表达水平比较低的蛋白，需要叠氮糖的量就会更高，这不利于细胞的生长，因此需要一种更好的策略，在保证荧光强度的同时降低叠氮糖的用量。

基于DNA扩增的新策略

在这项工作中，一个新的策略被设计出来。叠氮基团整合进入多糖，与炔官能化的DNA进行Click反应。偶联后的DNA复合物可以启动在聚合酶存在下的RCA（滚环扩增）反应，产生长串联重复序列。产物与大量荧光杂交检测探针结合可以产生高强度的荧光。由于这个过程是一个级联放大的过程，因此需要的叠氮糖的量大大减少。

图 3 该策略示意图

与FRET（荧光能量共振转移）共同应用

FRET是一种重要的技术，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强。该方法能够帮助确定靶蛋白，也可以用来寻找蛋白质相互作用的关系。

当供体荧光比较弱的时候，是很难激发出受体的荧光的，在这种情况下，此项工作提出的策略就有很大的优势了。提高了荧光强度之后，可以在原来不能产生FRET的情况下产生FRET。在此项工作中，已经证明了利用这种策略和FRET来确认蛋白的可能性。

图 4 利用FRET检测膜蛋白

该方法的优势

在此，我们可以总结一下这个方法的优势。概括起来，就是利用更少的叠氮糖用量来达到更高的荧光强度，以此来完成更精确的监测。特别是由于细胞膜表面糖蛋白往往含量比较低，利用这种策略和抗体的联用，能够通过FRET现象确认膜蛋白的种类和分布。当然，由于引入了DNA和聚合酶参与这个过程，使得操作步骤变得复杂，不过在糖蛋白丰度比较低时，还是很值得应用此方法来提高荧光强度。总之，这种方法特别适合低丰度的糖蛋白检测，甚至使单分子糖蛋白检测有可能实现。