本文作者：海猫

导读

近日，中科院的马会民研究员团队在JACS杂志上发表论文，报道了一个最大发射波长超过1200 nm的近红外小分子荧光团FM1210。与相应的对照荧光团CF1065相比，FM1210的最大发射波长增加了145 nm，这是因为硒原子和氨基被同时引入到了分子骨架中。由于其最大发射波长的提高，FM1210可以在体内进行成像，并具有较低的自发荧光，较高的信噪比和更高的分辨率。被封装在脂质体中的纳米级FM1210具有被动靶向能力和良好的水溶性，并可以以高信噪比对肿瘤甚至其脉管系统成像。

Design, Synthesis, and Application of a Small Molecular NIR-II Fluorophore with Maximal Emission beyond 1200 nm
Yu Fang, Jizhen Shang, Diankai Liu, Wen Shi,* Xiaohua Li, and Huimin Ma*
J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 15271-15275 DOI: 10.1021/jacs.0c08187  https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c08187

正文

处于近红外二区（NIR-II）的荧光团（1000-1700 nm）因其具有良好的成像能力和更深的肿瘤穿透能力引起了人们广泛的兴趣。目前，NIR-II荧光团主要是基于无机纳米材料，但往往具有毒性，所以在临床使用中尚不普遍。而有机小分子染料，诸如亚甲基蓝和吲哚菁绿（ICG）已经在临床中使用数年，并尚无明显安全问题出现。因此，有机荧光团在体内成像中更具优势。迄今为止，主要有两种NIR-II有机小分子荧光团，一种是聚次甲基染料，其Stokes位移较小，且化学稳定性较差；另一种是具有供体-受体-供体（D-A-D）结构的荧光团，其中一类比较具有代表性的骨架是苯并[1,2-c:4,5-c’]双([1,2,5]噻二唑)（BBTD）衍生物。与聚次甲基相比，D-A-D结构的荧光团具有更大的Stokes位移（>200 nm），并且在体内成像具有更高的信噪比。然而现有的基于BBTD骨架的荧光团的主要吸收和发射波长分别限制在800和1000 nm，如何去突破这一限制成为了探针方面的前沿热点之一。
为此，作者研究了近些年关于BBTD骨架荧光团的研究，发现：1）将硫原子替换成硒原子可以提高荧光团的发射波长；2）在骨架中引入供电子的氨基也可以提高这些波长。然而这些方法也只能将波长提高不超过50 nm，如何进一步优化结构还是一个挑战。在这篇文章中，作者将硒原子和氨基同时引入到BBTD骨架中，并预测这样的组合可以导致一个较大的波长提高。按照这个思路，他们设计了一个新的有机小分子荧光团FM1210（Scheme 1），其最大发射波长为1210 nm，并将它的光学性质和仅引入氨基基团，骨架中仍为硫原子的对照荧光团（CF1065）进行比较。相较CF1065而言，FM1210的发射波长红移了145 nm，且量子产率和亮度相差不多。比起仅进行一个修饰而言，同时进行两种修饰的波长提高增加了三倍，这可以归因于硒原子和氨基的协同作用。FM1210也因此在体外成像中具有更好的潜力，在小鼠体内荧光成像可以达到100 fps的帧率。并且，封装在脂质体中的纳米级FM1210（FM1210-NPs）可以以高信噪比在体内对肿瘤和其脉管系统进行成像。

FM1210、CF1065以及其他对照化合物的合成方法详见Supporting Information。作者首先测定了FM1210和CF1065的吸收和荧光谱图。由Figure 1所示，溶于二氯甲烷的FM1210在980 nm处有较强的吸收峰，在1210 nm处有较强的荧光发射，荧光量子产率为0.036%。而CF1065的最大吸收波长和最大发射波长分别为855和1065 nm，荧光量子产率与前者相当（0.041%）。在其他有机溶剂中，FM1210和CF1065的量子产率和亮度都有所下降但比较相似。为了探索分子结构与其光学性质的关系，作者设计了不同结构的类似分子并将它们比较（详见SI），发现硒原子和氨基的同时存在导致了波长的较大红移，这一结果也与能隙的理论计算结果相符。

在磷酸缓冲液（PBS）中，FM1210和CF1065都表现出了较弱的荧光（量子产率<0.01%）。然而将这些染料加入胎牛血清（FBS）或含有白蛋白的PBS溶液中时，这两种染料都表现出较明显的荧光，可能是因为染料与蛋白质形成了配合物。并且，这两种染料在胎牛血清中都比较稳定，因此它们可能比较适合对血管进行成像。作者还发现，FBS和白蛋白可能会导致这两种荧光团最大发射波长的蓝移。
FM1210优异的光学性质，较低的细胞毒性与器官毒性引发作者去进一步探索其体内成像的能力。首先，作者测量了BALB/c裸鼠在808 nm和980 nm激发下的自荧光，发现在980 nm下自荧光显著降低，从而验证了更大的波长激发确实可以有效地降低生物体的自荧光。
在静脉注射FM1210或CF1065之后，血管中可以看见明显的荧光（Figure 2）。将二者进行对比，可以发现注射了FM1210的血管成像（Figure 2a）要比注射了CF1065（Figure 2e）的分辨率更高，放大后的腹部血管与股动脉血管图像也要更清晰些（Figure 2c与2g，2b和2f）。此外，从股动脉血管横截面（Figure 2b和2f中的白线）进行的荧光强度分析显示出存在四个血管，Figure 2d中四个峰的半峰全宽分别为0.24，0.20，0.20和0.19 mm，Figure 2h中的峰宽分别为0.20，0.35，0.18和0.30 mm。使用FM1210，CF1065和ICG进行成像，股动脉血管与组织的荧光信号比分别为2.15±0.10，1.77±0.19和1.19±0.04。以上结果表明，FM1210可以显著提高体内成像的信噪比。此外，作者还研究了FM1210在小鼠血液循环和尿液排泄中的荧光动力学，它在血液循环和尿液排泄中的预测半衰期分别为4.6±0.2 h和1.6±0.2 h。

因为NIR-I区的染料的体内穿透能力有限，很难得到高质量的成像。因此，作者使用FM1210对麻醉小鼠的整个身体进行了高速成像。即使在640*512像素的分辨率下，也可以获得100 fps的清晰NIR-II视频。这可能是现在最高的NIR-II成像速率。作者通过该成像测量出了每分钟234拍的心率，且心房搏动和心室搏动之间约0.12 s的细微延迟可以通过高速成像分辨出（Figure 3B）。作者还以相同的方式对未麻醉的小鼠进行成像，测量出其每分钟420拍的心率。因此，FM1210有前景用于心脏研究中。

荧光纳米颗粒的被动靶向能力，良好的水溶性和生物相容性使其在肿瘤成像中有较大的优势。因此，作者将FM1210封装在脂质体中，生成纳米级FM1210-NPs，其粒径约为20-22 nm。FM1210-NPs在PBS溶液中比FM1210的荧光要更强一些，且它在24小时内展现出高稳定性，低毒性和良好的水溶性，预测其在血液循环和尿液分泌中的半衰期分别为5.7±0.4 h和2.3±0.3 h，比FM1210在体内的保留时间要长。通过尾部对携带HeLa肿瘤的小鼠进行FM1210-NP静脉注射时（Figure 4），可以清楚地观察到肿瘤中丰富细化的脉管系统，并可以清楚地识别出扩张的血管和毛细血管（Figure 4B）。此外，肿瘤中的荧光强度在开始时逐渐增加，并随时间而下降，这是因为FM1210-NPs在体内的动态变化（Figure 4C）。从Figure 4C可以看出，FM1210-NP倾向于在肿瘤中聚集，且肿瘤与正常组织的最高荧光比值出现在4小时。而对FM1210做相同的研究，荧光信号并未集中在肿瘤区域。这些结果表明，纳米级的FM1210-NPs可以用于有效对肿瘤细胞进行成像。

结语

中科院马会民研究员团队报道了一个新型的FM1210荧光团，其最大发射波长为1210 nm。与CF1065相比，FM1210的最大发射波长增加了145 nm，这主要是因为骨架中同时引入了Se原子与氨基。与CF1065相比，FM1210具有更低的背景信号，更高的分辨率与信噪比，使用FM1210进行体内成像，可以实现100 fps的高速NIR-II成像。此外，纳米级FM1210-NPs能够对肿瘤甚至其脉管系统进行成像。总的来说，FM1210在体内成像方面优于小分子染料，有望进一步应用于临床医学成像中。