利用试剂诱导样品发色/发光，根据此发色/发光的程度来进行测试/鉴定样品中目标化合物的浓度。比色法在食品化学、环境分析、生物化学等众多领域都有都十分受到青睐。

今天的话题，就是比色法具体在什么样领域下、有什么样的功能、并且简单介绍一下相关原理。那么！开始吧！

比色法在数量众多的各种测试方法中，其原理（也许。。。）也是最简单的了。不过读者朋友们中应该也有人不知道吧~~~所以，让笔者先简单介绍一下基本原理吧~~~

例如，将需要测定的化合物视为A，A与发色试剂混合发生化学反应，生成B化合物（图1）。

图1 比色法基本原理

B化合物有颜色，可以利用此颜色的深浅数值化B的浓度，间接测定A的浓度。如果A的浓度和B的浓度成比例的话，根据现有的标准曲线，可以根据B的颜色深浅判定A的浓度大小。

图2 标准曲线

生物化学方向的读者朋友们自不必说了，其他化学方向的读者们不知道遇到过需要测定自己合成的化合物（组装体、探针）在做生物实验之前，一般来说需要知道他的毒性，也就是利用培养细胞的细胞毒性实验，这一实验可以测定化合物的毒性大小以及细胞凋亡的过程，在人类治疗药物等方面的研究有非常巨大的作用，许许多多科学家们都在使用。那么，怎么判明细胞的凋亡以及其凋亡比例呢？？这一点实际上是一个比较麻烦的问题，但是从科研角度出发，一般利用trypan blue排除試験　(1)ＭＴＴ法等比色法　(2)使用AlamarBlue等的荧光法。

本次，就让我们介绍比色法当中的MTT法(MTT assay)吧！！MTT的分子式是C₁₈H₁₆BrN₅S，是四唑盐类的一种。MTT细胞中线粒体当中的脱水剂相互反应会生成Formazan，而这个Formazan是一种蓝色的非水溶性晶体（固体），生成之后立刻沉淀¹⁾。在使用DMSO之类的有机溶剂溶解后，混合均匀后形成紫色溶液，随后检测此溶液于570nm出的吸光度。

MTT自身的水溶液是黄色的，如图3，由于脱氢酶的作用，MTT与NADH之间进行氧化还原反应，MTT还原为Formazan，NADH氧化为はNAD⁺。此脱氢酶是与线粒体呼吸过程相关的酶，也是细胞健康状况的指标。细胞处于健康状态时，酶的活性高因而可以进行MTT的还原，而如果细胞活性很弱的情况下，MTT还原则很难进行，如果细胞死亡则完全不会进行。所以，此时颜色的深浅则可以反应了浓度。也就是，酶活性程度反映了颜色的浓度。并且，此方法有很好的标准曲线用于细胞计数。

顺道简单介绍一下实验方法吧！详细请参考文献。^{2), 3)}

1.　将培养细胞等量地放入 MULTIWELL PLATE等中。
2.　预先将MTT溶解于PBS当中。
3.　进行实验时，将对照组試験（通常只有培养液）与实验组（含有试剂的培养液）同时进行培养。
4.　随后，将各组都交换为普通的培养液，加入2中制备好的MTT溶液，培养三小时。
5.　除去培养液，加入DMSO，溶解好沉淀的Formazan。
6.　测定570 nm处的吸光度。
7.　以对照组的细胞生存率为100%，与实验组进行比较计算。

在MULTIWELL PLATE上进行实验，实际的样子如图4。

图4 MULTIWELL Plate上的简单示意图

以上就是ＭＴＴ法的简单概要了。学术论文学当中一般都用此方法评价细胞毒性。

今后，我们还将为大家介绍一下食品化学当中使用的比色法！！敬请期待！！！

1.  Mosmann, T., “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.” J. Immunol. Methods1983, 65, 55-63.
2. Pereira, C., Oliveira, C.R., “Oxidative glutamate toxicity involves mitochondrial dysfunction and perturbation of intracellular Ca2+ homeostasis.” Neurosci. Res. 2000, 37, 227-236.
3. 同仁化学研究所（株）プロトコル集より
4. ＭＴＴの生物学的な反応機構: Liu, Y. et al., “Mechanism of Cellular 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2H Tetrazolium Bromide (MTT) Reduction.” J. Neurochem. 1997, 69, 581-593.