作者：苏打水

导读：

近日，中国科学院的张华教授团队报道在J. Hazard. Mater.中发表论文，报道一种结合 CRISPR/Cas12a 和环介导等温扩增 (LAMP) 的便携式生物传感器，用于现场快速检测 抗生素抗性基因（ARG），为快速评估废水中的ARG 丰度提供了一种潜在的方法。

Portable biosensor combining CRISPR/Cas12a and loop-mediated isothermal amplification for antibiotic resistance gene ermB in wastewater

K. Mao, H. Zhang, F. Ran, H. Cao, R. Feng, W. Du, X. Li, Z. Yang, J. Hazard. Mater. 2024, 462, 132793. Doi: 10.1016/j.jhazmat.2023.132793

正文：

抗生素抗性基因（ARG）是广泛存在的污染物，对环境和公众健康构成严重威胁，尤其是废水中的ARG是环境中ARG的重要来源。因此，监测和评估废水中的 ARG 丰度对于环境管理具有重要意义^[1]。

这里，中国科学院的张华教授团队将LAMP与CRISPR/Cas12a^[2]结合，建立了用于检测大环内酯类抗性基因ermB的便携式视觉平台，首先设计了LAMP的6个引物和CRISPR/Cas12a的crRNA，用LAMP进行预扩增，并通过碱基配对引导Cas12a识别ermB。由于CRISPR/Cas12a在扩增子识别后具有反式切割活性，使用报告分子修饰的ssDNA探针通过侧流试纸条和荧光进行可视化检测^[3]。经过磁珠简单的核酸提取后，所构建的生物传感器具有优异的灵敏度和选择性，使用荧光和废水中的流条可以低至2.75 × 10³ copies/μL，实现了快速、灵敏的可视化现场检测。

如Fig.1a所示，该生物传感器的检测过程包括以下步骤：过滤和裂解预处理、磁珠提取、LAMP预扩增、CRISPR/Cas12a系统识别和转导、荧光和横向检测。作者首先设计了针对 ermB 基因的 LAMP 引物，接下来，设计了Cas12 crRNA来特异性识别和检测LAMP预扩增的ermB基因。以一段crRNA为指导RNA，Cas12a可以识别与crRNA识别片段互补的ermB片段。目标序列被识别后，其对 ssDNA 探针进行非特异性切割的反式切割活性被激活。之后，设计了用荧光和相应的猝灭剂修饰的单链DNA探针(5′−6-FAM-TTATT-BHQ1–3′)和用荧光和生物素分子修饰的单链DNA探针(5′−6 -FAM-TTATTATT-Biotin-3′) 分别用于荧光和侧流装置中的可视化检测。

在荧光检测中，在 Cas12a 反式切割存在的情况下，ssDNA 荧光探针解离，释放猝灭剂以恢复荧光信号。结果可以通过荧光读数装置或特定光源激发来直观地读取（Fig. 1b）。相反，在没有靶标的情况下，由于缺少激活的Cas12a，ssDNA探针不会被切割, 因此，没有产生荧光信号。

在可视化的侧流检测中，侧流探针的每一侧都用 FAM 和生物素进行了预修饰。比色侧流试纸条通常由带有 gt 抗 FAM 抗体修饰的金纳米颗粒(AuNP) 的样品垫、一条用链霉亲和素标记以捕获生物素的对照线和一条带有标记的抗 gt 抗体以捕获 gt 抗体的测试线组成。如果没有特异性的 LAMP 产物，ssDNA 探针保持完整，并且由于生物素和链霉亲和素的结合，AuNP 可以固定到对照线上，导致红色沉积。相反，AuNPs 复合物通过 AuNPs 和生物素的分离以及 gt 抗体与抗 gt 抗体的结合而固定在测试线上，形成红色条带。

为了评估LAMP在检测ermB基因时的灵敏度，将PCR扩增产生的目标DNA片段以10倍梯度稀释。结果Fig. 2所示，荧光 LAMP 成功检测到 ARG ermB，LOD 为 2.75 × 10 ³ copies/μL。DNA浓度与循环阈值时间（CT）之间存在良好的线性关系，线性范围跨越8个数量级，最高可达2.75×10 ¹⁰ copies/μL。

为了进一步提高分析方法的特异性，研究人员将CRISPR/Cas12a系统引入检测中，以解决潜在的假阳性问题并提高灵敏度（Fig  3. a, b）。接着，为了满足复杂现场条件下可视化的各种可能要求，使用荧光和侧流试纸进行可视化检测分析(Fig  3. c, d)。

之后，为了验证构建的基于CRISPR/Cas12a的视觉平台的准确性和可靠性，对原废水进行了现场检测（Fig. 4）。结果表明，构建的CRISPR/Cas12a可视化平台能够实现废水中ARGs的快速现场检测。

总结：中国科学院的张华教授团队开发了一种基于 CRISPR/Cas12a 的便携式可视化生物传感器，用于快速现场检测和评估废水中的 ARG。从取样到出结果的检测过程在2小时内完成，不需要复杂的仪器。该方法成功克服了LAMP的假阳性问题，同时能够目视检测废水中低于2.75 × 10 ³ copies/μL的ARG ermB，可作为废水定性和相对定量分析的有效工具。

参考文献：

• [1]  Z. Han, Y. Zhang, W. An, J. Lu, J. Hu, M. Yang, Water Res. 2020, 183, 116088. Doi: 10.1016/j.watres.2020.116088
• [2] J. S. Gootenberg, O. O. Abudayyeh, J. W. Lee, P. Essletzbichler, A. J. Dy, J. Joung, V. Verdine, N. Donghia, N. M. Daringer, C. A. Freije, C. Myhrvold, R. P. Bhattacharyya, J. Livny, A. Regev, E. V. Koonin, D. T. Hung, P. C. Sabeti, J. J. Collins, F. Zhang, Science 2017, 356, 438-442. Doi: 10.1126/science.aaq0179
• [3]  F. Hu, Y. Liu, S. Zhao, Z. Zhang, X. Li, N. Peng, Z. Jiang, Biosens. Bioelectron. 2022, 202, 113994. Doi: 10.1016/j.bios.2022.113994

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