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蛋白质定量——紫外吸收法UV Absorption

译自Chem-Station网站日本版 原文链接:タンパク質の定量法―紫外吸光法 Protein Quantification – UV Absorption

翻译:炸鸡

蛋白质中有能够吸收紫外光的氨基酸残基。尤其是酪氨酸・色氨酸侧链的吸收波长在280nm左右。缓冲溶液中很少有280nm附近的吸收峰,所以通过在280nm波长下测量吸光度(A280),依据Lambert-Beer法则就可以推算出蛋白质在缓冲溶液中的浓度了。当A280 = 1.0 (l =1 cm)时,蛋白质的浓度约为1 mg/mL。

但是蛋白质的酪氨酸・色氨酸含量有差异,所以这个方法并不是十分严谨。优点是操作简单,可即时测定,样品能回收。

  • 可回收样品并再次利用样品
  • 操作简单且迅速

  • 测定范围只有05-2 mg/mL,灵敏度较低
  • 无法测量不含芳香族氨基酸的蛋白质(如胶原蛋白)
  • 不同蛋白质吸光度不同
  • 如果被有紫外吸收的物质污染,测量结果会受影响[2]

图片出自这里

  • 需要注意的是核苷酸类在260~280 nm处有吸收。如果A280/A260<1.5,很可能混入了核苷酸,需要用其他办法定量蛋白质。如果核苷酸含量较少就用下列校正公式计算蛋白质浓度[3]。

图片出自这里

  • 紫外测定吸收用的样品槽是用石英制的。不能用塑料或玻璃。
  • 使用Nanodrop的装置,可以测量1-2μL液体。
  • 280nm处的摩尔吸收系数(ε280)可以通过色氨酸-酪氨酸-半胱氨酸二聚体(胱氨酸)的含量计算出来,具体公式如下[4]。它也可以通过在这个网站上输入主序列来计算。

ϵ280 [M-1cm-1]= nW x 5,500 + nY x 1,490 + nC x 125 (C = cystine)

  1. ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき2018, 1, 2. [PDF]
  2. “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M. Methods Enzymol.1990, 182, 50. doi:1016/0076-6879(90)82008-P
  3. ”Isolation and Crystallization of Enolase” Warburg, O.; Christian W.  Z.1942, 310, 384.
  4. “How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein” Pace, C. N.; Vajdos, F.; Fee, L.; Grimsley, G.; Gray, T. Protein Sci.1995, 4, 2411. doi:1002/pro.5560041120

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