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当使用NMR检测出现问题时

本文来自Chem-Station日文版 NMRの測定がうまくいかないとき 作者  Gakushi

翻译投稿 炸鸡 校对 Jiao Jiao

今天来总结下使用NMR时出现故障时的应对方法。(因为笔者用的是Bruker user公司生产的NMR仪器设备,对JEOL公司生产的NMR仪器设备并不了解)直到现在,NMR还是一种价格昂贵的检测仪器。而且,因为使用频率很高,一旦它出现故障,大家都会很头疼。如果遇到麻烦,比起自己埋头蛮干不如找下技术人员需求帮助。

样品溶液量足够吗?

如果样品溶液的量太少,线圈温度太高,设备就会损坏。如果样品量(即溶质)太少,仍想精确检测化合物结构,就要保证溶剂充足(一定要保证去耦线圈的高度低于样品溶液的液面)。尽可能使用shigemi样品管(日本一家化学器械制造公司的产品)或者使用具有更好的磁铁和探头的NMR设备。如果长时间用低沸点溶剂进行恒温检测或非恒温检测,最好用薄膜将样品管盖子包裹起来。

样品的浓度为多少合适呢?

如果样品浓度很低,要注意在自动取样器中使用的自动锁场和匀场可能会发生意外。如果样品浓度极其地低的话,还可以手动调节锁场和匀场。(其原因是,NMR和MS不同,NMR是一种灵敏度非常低的测量方法,需要大量的样品,如果样品量很少,NS(扫描次数)必须达到128次以上,那样也需要大量的时间。如果化合物的定量供应不是问题,不要吝啬,要使用足够的量进行测量。例如,进行碳谱检测时,如果有20毫克到30毫克的13C话,测量很快就会结束。)

另一个方面来说,样品浓度太高,那么样品溶液粘度就会增加,样品溶液就会很容易变的不均一,因局部磁场的环境被扰乱了,信号峰会变宽。这种情况下,需要跟NMR技术人员确定是更换溶剂,还是降低样品浓度,抑或是升高检测温度。

没有沉淀物吗?

如果待测样品溶液有沉淀物,应提前过滤一下。如果NMR待测溶液浑浊的话,就无法得到干净的图谱。(在以前的实验室做络合物研究的时候,经常把浑浊的样品溶液拿去做NMR检测,当时内心还想应该没事吧。)

样品管没有问题吗?

如果样品管有弯曲,或是弄脏了的现象会使局部磁场环境不均匀分布,这样的话,只能将样品管丢弃了。(在检测1H时,因为样品管的原因,信号会不均匀,但spin(旋转)可以抑制信号不均一的现象,所以我并不建议你在测量氢谱时因为样品管弯曲而将样品管丢弃)再有,为了防止样品管发生弯曲,干燥样品管的时候应该避免热烘干,请在高真空环境下干燥。

一定需要锁场吗?

如果波峰出现在傅立叶变换后面,是因为锁场的原因。特别是在有CD3OD作为溶剂的时候,Auto Lock(自动锁场)难以发挥作用。这个时候,就要使用手动锁场。

一定要匀场吗?

需要精确检测时,在匀场自动调节后,可能需要手动再次调节匀场。再有,如果样品浓度太低,匀场会减弱。(Bruker的分光计变成了Avance Neo后,自动匀场的精度变高了,这样原本配套的BSMS keyboard就用不到了,改为在屏幕上控制。因此,必须在屏幕上调节Manual Shin(手动匀场),这将会变得很麻烦。为了弥补自动匀场调节的不方便,自动匀场调节后可手动微调匀场。)

如果匀场不匹配的时候,可以重新读取定期保存的匀场文件。

探头调谐了吗?

探头是否调谐对13C-NMR是很重要的。而且,如果没有调谐好的话,HSQC或HMBC是不会有信号峰(Cross peak)(笔者也一度犯过这样的错误)

样品无法出峰

如果样品没有出峰,可以考虑一下几种原因:空气不够流通,没有使用合适得到样品转子,检测过程中的操作失误等。这是一定不要贸然行事,必要的时候还是找技术人员寻求帮助吧。(从前,样品没有出峰的时候,按BSMS的键盘后面的复位键似乎有些作用)

使用标准样品检测

无论怎么做,还是检测不了的话,用标准样品做NMR检测一下试试。如果即使这样也不能出峰,那只好和找技术人员寻求帮助了。

使用了合适的NMR设备吗?

以前的文章也有过介绍,使用装备了Inverse Probe(BBI、TXI)的设备来做碳谱,过了很长时间也没有反应。如果要得到高精度的碳谱图推荐使用装配有TCI或BBO的NMR设备或是Cryo。一方面来说,如果有2个重氢原子(D)的话,BBI或TXI仍然有效,要想得到好的谱图,不仅仅要保证磁体足够大,还要使用合适的探头。

再有,如果测量谱图和标准谱图的耦合峰有差异,如果要正确地显示出耦合峰,最好使用同样尺寸的磁体。

标准值和检测值有差异怎么办?

溶剂的种类

检测所用的溶剂一样吗?我们很容易忽视不同溶剂间的差别。在检测之前,一定要确认使用的溶剂和参考文献中的溶剂是否一样。

pH

胺类和羧酸作为溶剂的话,谱图会和标准谱图有出入的化合物,先判断是否为其相应的盐了,如果是盐的化合物的话,检查它们的种类是否相同。(如胺类化合物,像TFA三氟乙酸盐,FA氟乙酸盐,盐酸盐,对甲苯磺酸盐,根据他们所带的负离子不同,化学位移值也会有差异。如果没有标准谱图,要确认一下样品纯化条件(用RP-HPLC反相高效液相色谱检验)或结晶条件)。再有,也要检查样品溶液的pH值是否相同。比如,即使都是氟乙酸盐,pH值不同,信号峰的化学位移值又会不同。

检测浓度

一定要确认检测浓度是否和文献里的一样。如果浓度相差太大,浓度也会随着化合物形成二聚体而发生变化。(因此,在天然化合物分离文献中,对化合物结构进行结构检测时,文献中常常会附带记载着检测时的检测浓度。)

NMR谱图信号杂乱

有的合成的化合物在CDCl3溶液中不稳定,比如乙酰醚、二级乙醚、乙醇醚等在微量的酸中不稳定,经常在检测前或检测中分解。在这种情况下,我们可以用C6D6、toloene -d8或DMSO-d6作为溶剂来进行检测。或者,预先用碱性氧化铝填充的滴管微柱将CDCl3中的酸去除来使待测化合物在CDCl3中稳定。还有一种方法,就是长时间检测(13C或2D)后再一次检测1H(扫描次数为2),这样可以很轻松地判别出NMR检测的化合物有没有分解。

在以后的文章中会提到,仲胺,环烷烃(拥有8-11个碳原子)化合物和非手性化合物等容易变成旋转异构体,在NMR检测时,在一定的信号比率下,一个信号峰会分成两个。这种情况下,需要使用变温NMR进行检测。

信噪比不佳

有时候因为检测环境或之前样品检测、设定和以往不同,另外NMR探头使用过程慢慢被污染,都会使信噪比变得不佳。(我曾让NMR的技术人员给我看过在正常用了6个月的探头,每天只进行20个左右的样品的测量,但探头依然相当脏。)如果觉得很难调节的话,问技术人员是最好的办法。

在检测氢谱时,有时我们可以不用考虑峰面积的积分比,使用缩短检测时间(aq) 的办法更为简单。我们可以好好利用aq,不过,需要注意一般的质子的弛豫时间T1是0.5-4.0,如果检测时间太短,信号峰的积分值会消失,这一点要格外注意。(我一边设定aq为3.0,再短一点的话是2.0,不过我个人的意见是选择合适的NMR设备和探头而不是通过缩短aq来调节信噪比)

 13C丰度太低

首先确定像叔丁基二甲基硅基之类,相同的甲基是否有峰重叠的现象。

因为季碳原子的弛豫时间很长,即使施加90个单位的脉冲,也需要过很长时间才能得到谱图,因此建议把弛豫时间参数延长,然后再测量一次。

当检测氢谱信号峰变宽时,可能不会看到13C信号峰(如果稍微调整下参数,13C的信号峰可能会显示出来)。首先,改变NMR溶剂及其浓度,调剂pH值,尽可能使1H的信号峰清晰,则有可能观测到13C信号峰。如果还得不到清楚的碳原子信息,可以通过使用HSQC或HMBC确认碳原子信号峰。

如果碳原子附近存在F原子,那么碳谱信号峰会因为耦合发生分裂,分裂为很多个信号峰,信号强度会减弱。为了能比较清晰地收集信号,最好选用浓度高的样品溶液。另外,笔者虽然没有使用通过提高样品浓度的方法,但使用了19F来起到去耦的作用。

直接与B(硼)相连的碳原子在碳谱中经常无法观测到对应的信号峰,需要通过HMBC谱图确定13C位置并且要改变测量参数。(用于偶联反应的硼酸中有sp2杂化的碳,因此需要HMBC。因为笔者没有接触过烷基化合物,所以不知道会有什么样的反应。如果B结合在饱和碳上,可以用更高灵敏度的HSQC来检测碳原子是否存在。)通常情况下是很难看到13C对应的信号峰的,用SI和11B-NMR时,即使看不到13C的单信号峰也不要紧。(因为观测到碳原子的信号峰很难,所以文章里采用的方法只能适用于当碳原子信号峰对结果影响不大的时候。)

其他的建议

市面上有卖细细长长的NMR专用的玻璃滴管。我自己不怎么用,但取样的人经常使用。当样品回收时不好取的时候,是否可以考虑买些这样的滴管会方便些?

实验室常备自动取样器,避免检测的样品很多时容易将自己的样品和其他人的样品弄混。或者使用不同颜色的样品管帽或者在样品管帽上写上自己名字的大写字母,以便于区分。(另外,也能降低被别人拿走样品被错扔的风险。)

后记

最后再说一句,NMR是很昂贵的仪器。遇到问题时,首先要冷静。如果没有信心解决的话,最好求助于技术人员或者指导人(至少也得是实验室的前辈吧)。

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