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仅用唾液即可检测!? 1 atto mol以下的超高灵敏度抗体检测方法

HIV斯坦福大学的 Carolyn R. Bertozzi教授课题组,开发了用于高灵敏度检测抗体的技术(Agglutination-PCR:凝集PCR法)、可以成功地检测到唾液中痕量存在的高度敏感的HIV抗体。

“Antibody detection by agglutination–PCR (ADAP) enables early diagnosis of HIV infection by oral fluid analysis”

Tsai, C. T.; Robinson, P. V.; Cortez, F. J.; Elma, M. L. B.; Seftel, D.; Pourmandi, N.; Pandori, M. W.; Bertozzi, C. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018. DOI: 10.1073/pnas.1711004115

1. HIV是?

(引用自:美国卫生和人类服务部 AIDSinfo。)

HIV(human immunodeficiency virus种感染人体免疫细胞的病毒。随着艾滋病毒对免疫系统的破坏,逐渐从病毒感染到转变成为艾滋病的状态,艾滋病通常会使人体丧失对感染性病原体的抵抗力并导致各种疾病。现在,对于艾滋病的治疗药物的研发正在不断取得进展,并不像过去那样“艾滋病=致命疾病”,但是由于艾滋病毒的潜伏期长达5至10年,即使有时候感染了而不知,因此传染给其他人的风险还是很高。因此,对艾滋病毒的早期检测就显得尤为重要。

那么,如何检查HIV感染的存在与否,目前的主流检测方法是验血。当感染艾滋病病毒时,体内会产生抗体,因此可以通过检查血液样本中所含的艾滋病毒抗体的数量来查看是否感染了艾滋病毒。然而,对于大众来说,血液检查比皮肤贴片检测和唾液检测更敏感,不管从操作上还是个人心理上都相对的难接受一点。对于非洲这种医疗环境比较落后的地区,艾滋病虽然仍然是导致死亡的主要原因之一,但是在卫生控制不足的环境中使用注射器进行血液检测是非常有风险的。

如果能够在唾液中检测HIV抗体,那么HIV的检测就可以变得更加安全,方便。但是,由于唾液中仅存在痕量的HIV抗体,因此难以通过酶免疫测定(EIA)等常规方法进行检测。

因此,Bertozzi教授及其同事开发了一种称为凝集 – 聚合酶链反应(agglutination PCR)的技术[1],该技术结合了抗体凝集反应和通过PCR扩增DNA以检测微弱存在于唾液中的HIV抗体。

2. Agglutination–PCR法的机制

测定手法如下所示(图1b, c)

  1. 制备与抗原HIV蛋白质的结合的一条DNA链,形成抗原-DNA结合体(图1b)。
  2. 与想要测定抗体量的样品混合。→ 抗原与抗体反应。
  3. 加入交联DNA和DNA连接酶。→ 形成一条DNA
  4. 加入引物和DNA聚合酶。→DNA的扩增。
  5. 通过定量PCR法测量扩增的DNA的量。

图1. Agglutination–PCR法的机制。

在该方法中,通过交联DNA和DNA连接酶的作用修复了在5’侧和3’侧分成一半的DNA(图1b),从而形成可扩增的全长DNA。半段DNA,因为只有一个引物结合位点,DNA不会被扩增。借助存在于测量样品中的抗体,使得抗原-DNA彼此发生交联、然后仅仅对于形成的full-size的DNA通过PCR进行DNA扩增。

3. 临床样本的HIV抗体测定

首先,将纯化的HIV抗体稀释至各种浓度并进行测量,对于各种HIV蛋白(p24,gp41,gp160)作为抗原进行抗原-抗体反应,发现只需要110, 880, 550 zeptomol (10-21mol)的灵敏度就能检测确认。

继而,使用真实的唾液样本进行了HIV抗体测量。图2、是使用各种HIV蛋白(p24, gp41, gp120, gp160)作为抗原进行定量PCR(qPCR)的结果。在qPCR中,Ct值意味着DNA达到一定量的扩增需要的循环次数。这里,y轴表示空白Ct与测定样品的差值(Ct),值越大表示HIV抗体检测量越高。从图中可以看出,每个HIV蛋白中HIV阳性和阴性样本之间存在明显的差异(P <0.05)。

图2. 通过Agglutination–PCR 进行临床样本的HIV抗体测定。(引用自论文)

另外,对于使用现有的手法(EIA法)无法测出是否含有HIV抗体的唾液样本,通过使用Agglutination–PCR法进行了测定。8个样本进行测量后发现6个显示出了阳性。其中对对应的一个血液样本进行血液抗体测定验证后发现,与Agglutination–PCR法结果一样显示出了阳性。因此,利用该新手法很有可能实现唾液中HIV感染的早期诊断。

 

4. 文末

这次介绍的Agglutination–PCR法、只需要1 µL的样本,就可以检测到zepto(10-21)〜atto(10-18)mol的抗体。抗体检测不仅仅对于HIV感染,对于I型糖尿病,甲状腺癌等的诊断也是至关重要的,因此很期待进一步的改进与实现临床应用。

参考文献

  1. Tsai, C.-t.; Robinson, P. V.; Spencer, C. A.; Bertozzi, C. R. ACS Cent. Sci. 2016, 2, 139.  DOI: 10.1021/acscentsci.5b00340

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LuWenjie

LuWenjie

京都大学药学博士,现某化学企业小职员,化学空间员工副代表,网页小编&翻译。

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