化学习题

比色法化学(上篇)

 读者朋友们,知道比色法吗??

利用试剂诱导样品发色/发光,根据此发色/发光的程度来进行测试/鉴定样品中目标化合物的浓度。比色法在食品化学、环境分析、生物化学等众多领域都有都十分受到青睐。

今天的话题,就是比色法具体在什么样领域下、有什么样的功能、并且简单介绍一下相关原理。那么!开始吧!

5分钟理解比色法!

比色法在数量众多的各种测试方法中,其原理(也许。。。)也是最简单的了。不过读者朋友们中应该也有人不知道吧~~~所以,让笔者先简单介绍一下基本原理吧~~~

例如,将需要测定的化合物视为A,A与发色试剂混合发生化学反应,生成B化合物(图1)。

图1 比色法基本原理

B化合物有颜色,可以利用此颜色的深浅数值化B的浓度,间接测定A的浓度。如果A的浓度和B的浓度成比例的话,根据现有的标准曲线,可以根据B的颜色深浅判定A的浓度大小。

图2 标准曲线

细胞凋亡实验〜MTT法〜

生物化学方向的读者朋友们自不必说了,其他化学方向的读者们不知道遇到过需要测定自己合成的化合物(组装体、探针)在做生物实验之前,一般来说需要知道他的毒性,也就是利用培养细胞的细胞毒性实验,这一实验可以测定化合物的毒性大小以及细胞凋亡的过程,在人类治疗药物等方面的研究有非常巨大的作用,许许多多科学家们都在使用。那么,怎么判明细胞的凋亡以及其凋亡比例呢??这一点实际上是一个比较麻烦的问题,但是从科研角度出发,一般利用trypan blue排除試験 (1)MTT法等比色法 (2)使用AlamarBlue等的荧光法。

本次,就让我们介绍比色法当中的MTT法(MTT assay)吧!!MTT的分子式是C18H16BrN5S,是四唑盐类的一种。MTT细胞中线粒体当中的脱水剂相互反应会生成Formazan,而这个Formazan是一种蓝色的非水溶性晶体(固体),生成之后立刻沉淀1)。在使用DMSO之类的有机溶剂溶解后,混合均匀后形成紫色溶液,随后检测此溶液于570nm出的吸光度。

图3  MTT法的原理

MTT自身的水溶液是黄色的,如图3,由于脱氢酶的作用,MTT与NADH之间进行氧化还原反应,MTT还原为Formazan,NADH氧化为はNAD+。此脱氢酶是与线粒体呼吸过程相关的酶,也是细胞健康状况的指标。细胞处于健康状态时,酶的活性高因而可以进行MTT的还原,而如果细胞活性很弱的情况下,MTT还原则很难进行,如果细胞死亡则完全不会进行。所以,此时颜色的深浅则可以反应了浓度。也就是,酶活性程度反映了颜色的浓度。并且,此方法有很好的标准曲线用于细胞计数。

实验方法

顺道简单介绍一下实验方法吧!详细请参考文献。2), 3)

1. 将培养细胞等量地放入 MULTIWELL PLATE等中。
2. 预先将MTT溶解于PBS当中。
3. 进行实验时,将对照组試験(通常只有培养液)与实验组(含有试剂的培养液)同时进行培养。
4. 随后,将各组都交换为普通的培养液,加入2中制备好的MTT溶液,培养三小时。
5. 除去培养液,加入DMSO,溶解好沉淀的Formazan。
6. 测定570 nm处的吸光度。
7. 以对照组的细胞生存率为100%,与实验组进行比较计算。

在MULTIWELL PLATE上进行实验,实际的样子如图4。

图4 MULTIWELL Plate上的简单示意图

以上就是MTT法的简单概要了。学术论文学当中一般都用此方法评价细胞毒性。

今后,我们还将为大家介绍一下食品化学当中使用的比色法!!敬请期待!!!

参考文献

  1.  Mosmann, T., “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.” J. Immunol. Methods1983, 65, 55-63.
  2. Pereira, C., Oliveira, C.R., “Oxidative glutamate toxicity involves mitochondrial dysfunction and perturbation of intracellular Ca2+ homeostasis.” Neurosci. Res. 2000, 37, 227-236.
  3. 同仁化学研究所(株)プロトコル集より
  4. MTTの生物学的な反応機構: Liu, Y. et al., “Mechanism of Cellular 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2H Tetrazolium Bromide (MTT) Reduction.” J. Neurochem. 1997, 69, 581-593.
 本文版权属于 Chem-Station化学空间, 欢迎点击按钮分享,未经许可,谢绝转载!
The following two tabs change content below.

XJ Zhang

南开大学毕业 文部省奖学金资助预计前往东京大学从事超分子化学 我仰望的天空不见月亮 我俯视的池塘也没有鱼儿 ——————看不见鱼和月的喵

Latest posts by XJ Zhang (see all)

Related post

  1. 躲避Dead End「全合成・教你摆脱绝境的一手」⑦ 问题篇
  2. 在创药开发上频繁使用到的有机反应
  3. 话一话偶联反应中Pd催化剂的小故事
  4. Azaspiracid-1 by K. C. Nicolaou …
  5. Discodermolide by S. J. Mickel (…
  6. 苯环狂人记法
  7. 化学空间2016年人气记事排行榜
  8. 里宾斯基五规则(Lipinski’s “Rule of Five…

Comment

  1. No comments yet.

  1. No trackbacks yet.

You must be logged in to post a comment.

Pick UP!

PAGE TOP