化学习题

比色法化学(上篇)

 读者朋友们,知道比色法吗??

利用试剂诱导样品发色/发光,根据此发色/发光的程度来进行测试/鉴定样品中目标化合物的浓度。比色法在食品化学、环境分析、生物化学等众多领域都有都十分受到青睐。

今天的话题,就是比色法具体在什么样领域下、有什么样的功能、并且简单介绍一下相关原理。那么!开始吧!

5分钟理解比色法!

比色法在数量众多的各种测试方法中,其原理(也许。。。)也是最简单的了。不过读者朋友们中应该也有人不知道吧~~~所以,让笔者先简单介绍一下基本原理吧~~~

例如,将需要测定的化合物视为A,A与发色试剂混合发生化学反应,生成B化合物(图1)。

图1 比色法基本原理

B化合物有颜色,可以利用此颜色的深浅数值化B的浓度,间接测定A的浓度。如果A的浓度和B的浓度成比例的话,根据现有的标准曲线,可以根据B的颜色深浅判定A的浓度大小。

图2 标准曲线

细胞凋亡实验〜MTT法〜

生物化学方向的读者朋友们自不必说了,其他化学方向的读者们不知道遇到过需要测定自己合成的化合物(组装体、探针)在做生物实验之前,一般来说需要知道他的毒性,也就是利用培养细胞的细胞毒性实验,这一实验可以测定化合物的毒性大小以及细胞凋亡的过程,在人类治疗药物等方面的研究有非常巨大的作用,许许多多科学家们都在使用。那么,怎么判明细胞的凋亡以及其凋亡比例呢??这一点实际上是一个比较麻烦的问题,但是从科研角度出发,一般利用trypan blue排除試験 (1)MTT法等比色法 (2)使用AlamarBlue等的荧光法。

本次,就让我们介绍比色法当中的MTT法(MTT assay)吧!!MTT的分子式是C18H16BrN5S,是四唑盐类的一种。MTT细胞中线粒体当中的脱水剂相互反应会生成Formazan,而这个Formazan是一种蓝色的非水溶性晶体(固体),生成之后立刻沉淀1)。在使用DMSO之类的有机溶剂溶解后,混合均匀后形成紫色溶液,随后检测此溶液于570nm出的吸光度。

图3  MTT法的原理

MTT自身的水溶液是黄色的,如图3,由于脱氢酶的作用,MTT与NADH之间进行氧化还原反应,MTT还原为Formazan,NADH氧化为はNAD+。此脱氢酶是与线粒体呼吸过程相关的酶,也是细胞健康状况的指标。细胞处于健康状态时,酶的活性高因而可以进行MTT的还原,而如果细胞活性很弱的情况下,MTT还原则很难进行,如果细胞死亡则完全不会进行。所以,此时颜色的深浅则可以反应了浓度。也就是,酶活性程度反映了颜色的浓度。并且,此方法有很好的标准曲线用于细胞计数。

实验方法

顺道简单介绍一下实验方法吧!详细请参考文献。2), 3)

1. 将培养细胞等量地放入 MULTIWELL PLATE等中。
2. 预先将MTT溶解于PBS当中。
3. 进行实验时,将对照组試験(通常只有培养液)与实验组(含有试剂的培养液)同时进行培养。
4. 随后,将各组都交换为普通的培养液,加入2中制备好的MTT溶液,培养三小时。
5. 除去培养液,加入DMSO,溶解好沉淀的Formazan。
6. 测定570 nm处的吸光度。
7. 以对照组的细胞生存率为100%,与实验组进行比较计算。

在MULTIWELL PLATE上进行实验,实际的样子如图4。

图4 MULTIWELL Plate上的简单示意图

以上就是MTT法的简单概要了。学术论文学当中一般都用此方法评价细胞毒性。

今后,我们还将为大家介绍一下食品化学当中使用的比色法!!敬请期待!!!

参考文献

  1.  Mosmann, T., “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.” J. Immunol. Methods1983, 65, 55-63.
  2. Pereira, C., Oliveira, C.R., “Oxidative glutamate toxicity involves mitochondrial dysfunction and perturbation of intracellular Ca2+ homeostasis.” Neurosci. Res. 2000, 37, 227-236.
  3. 同仁化学研究所(株)プロトコル集より
  4. MTTの生物学的な反応機構: Liu, Y. et al., “Mechanism of Cellular 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2H Tetrazolium Bromide (MTT) Reduction.” J. Neurochem. 1997, 69, 581-593.
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XJ Zhang

南开大学毕业 文部省奖学金资助预计前往东京大学从事超分子化学 我仰望的天空不见月亮 我俯视的池塘也没有鱼儿 ——————看不见鱼和月的喵

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