本文作者：海猫

导读

在本文中，山西大学的阴彩霞课题组设计了一种荧光探针，可以特异性地检测去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）并对其进行体内成像。在社会压力日益增大的今天，受抑郁症困扰的人越来越多。研究表明，重度抑郁的内在原因是脑组织中去甲肾上腺素水平降低。去甲肾上腺素的结构与性质与另外两种儿茶酚胺神经递质—肾上腺素（epinephrine, EP）和多巴胺（dopamine, DA）非常相似，正因如此，设计对去甲肾上腺素特异的荧光探针非常具有挑战性。在这项工作中，作者采用了“保护-脱保护”策略：较长发射波长的花青（cyanine）染料被修饰上了水溶性磺酸盐，且被连接离去基团硫酚的碳酸酯保护；去甲肾上腺素中特殊的β-羟乙基胺部分可通过亲核取代和分子内亲核反应使保护基团离去，释放出荧光团，从而实现了去甲肾上腺素的特异性红色荧光检测。作者还实现了钾离子刺激下去甲肾上腺素神经信号转导的成像，并首次对抗抑郁药刺激后大鼠大脑中的去甲肾上腺素水平进行实时荧光成像。

Specific Fluorescent Probe Based on “Protect−Deprotect” To Visualize the Norepinephrine Signaling Pathway and Drug Intervention Tracers
Na Zhou, Fangjun Huo, Yongkang Yue, and Caixia Yin*
J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 17751-17755 DOI: 10.1021/jacs.0c08956  https://doi.org/10.1021/jacs.0c08956

正文

神经递质是神经元以特定方式与特定受体结合的化学物质。去甲肾上腺素作为一种儿茶酚胺神经递质，其脑内水平与抑郁症密切相关。去甲肾上腺素的结构与性质与另外两种儿茶酚胺神经递质—肾上腺素（epinephrine, EP）和多巴胺（dopamine, DA）非常相似。因此，设计对去甲肾上腺素特异的荧光探针非常具有挑战性。
传统的检测神经递质的方法主要依靠电化学分析和质谱法，然而使用这些方法，想要在体内原位检测是存在一些局限性的。在本篇文章中，作者使用了花青作为荧光团，在上面做了磺酸盐的修饰，以提高探针的水溶性；并将花青的六元环酮羰基部分用连接离去基团硫酚的碳酸酯来进行保护，作为去甲肾上腺素的反应位点（Scheme 1）。作者还使用这个探针描绘了在高钾浓度刺激下，去甲肾上腺素胞吐的过程；并首次实现了氟西汀（fluoxetine，一种典型的抗抑郁药物）诱导的体内去甲肾上腺素升高的原位成像。

探针的合成详见Scheme S1，终产物为深绿色固体，产率为21%。

该探针对去甲肾上腺素特异性反应的机理被质谱证实。使用HR-MS对终产物进行检测，结果显示存在[Cy7-OH] ²−峰（m/z = 353.13792），和另外一个五元环产物峰（m/z = 194.04537）。随后，作者在PB系统（pH 5.0）测定了该探针对去甲肾上腺素的UV-vis和荧光响应。如Figure 1a所示，加入去甲肾上腺素之后，在675和775 nm处的UV吸收随时间逐渐降低，而在550 nm处的UV吸收则逐渐增加；且系统的荧光强度在640 nm处逐渐增加，在60分钟之后，荧光强度提高14倍（Figure 1b）。反应后系统的光谱特性与Cy7-OH本身的光谱特性非常一致。
与去甲肾上腺素相比，多巴胺和肾上腺素仅能诱导较少的荧光强度增强（Figure 1c）。作者还研究了其他神经递质，例如5-HT，GABA和氨基酸（苏氨酸，丝氨酸和赖氨酸）等对探针的影响。结果显示，它们均未在检测系统中引起探针的明显荧光变化（Figure 1d）。对于具有相似巯基乙胺部分的半胱氨酸、同型半胱氨酸和GSH，也均未引起显著的荧光反应。并且，探针的响应时间比较短，反应在50分钟内完成，从而最大程度地减少了由氧化还原反应引起的去甲肾上腺素的损失。

去甲肾上腺素会在特定的细胞或组织中聚集，因此作者选取了几种细胞用来标记内源性的去甲肾上腺素。当探针与Hela细胞或者HepG2细胞一起在37度下培育40分钟时，在红色通道（red channel）下没有观察到荧光产生。而使用可分泌去甲肾上腺素囊泡的神经细胞PC12与探针进行孵育，则会观察到显著的红色荧光，并随着时间逐渐增强（Figure 2）。结果表明，该探针确实可以标记囊泡中的去甲肾上腺素。

有报道称高浓度的钾离子产生的动作电位（active potential）会促进细胞钙离子通道的打开，从而使钙离子从胞外流入细胞；细胞质内高浓度的钙离子会促进囊泡的产生，从而刺激神经递质的释放。作者用高钾离子浓度的溶液刺激标记了探针的PC12细胞，可以看到细胞内荧光强度显著降低；而使用PBS溶液，在相同的条件下进行观察，细胞内荧光强度没有明显变化（Figure 3）。这个结果可以说明高钾离子浓度确实会导致细胞对去甲肾上腺素的胞吐现象，而该探针可以实现对这一过程的成像。

作者使用这个探针进一步对脑组织进行标记。去甲肾上腺素能神经元往往分布于脑干蓝斑核，常使用TH和DBH或DBH和PNMT进行双重免疫标记（小编注：TH为所有儿茶酚胺能<catecholaminergic, CA>神经元的标记物，DBH针对去甲肾上腺素能<noradrenergic, NA>和肾上腺素能<adrenergic>进行标记，PNMT仅针对肾上腺素能进行标记1,2）。于是作者分别进行了TH和DBH双标记实验（Figure 4）；探针进行标记染色；还有PNMT和DBH的双标记实验（Figure 5）。如Figure 4所示，探针标记（b1, b2）与DBH-AF350标记（c1, c2）的荧光发射区域显示出广泛的重叠（e1, e2），这表明该探针对去甲肾上腺素能神经元具有特异性标记能力。在Figure 5中，通过DBH和PNMT的双重免疫标记印证了探针并没有标记肾上腺素，而是特异性标记了去甲肾上腺素。这种策略有利的证明了该探针在组织水平上的特异性标记能力。

接下来，作者在小鼠体内做了荧光成像实验。他们在小鼠背部右侧先后注射了探针和去甲肾上腺素，并在小鼠背后左侧先后注射了相同量的探针和PBS溶液。由Figure 6可以看出，随着时间的增加，小鼠右侧的红色荧光逐渐增加，但左侧对照组并无明显变化。因此该探针在体内检测去甲肾上腺素的能力得以证实。

最后，作者使用该探针验证了氟西汀（fluoxetine）刺激去甲肾上腺素释放的能力。实验还是在小鼠体内进行：他们先在小鼠腹腔内注射了盐酸氟西汀，过了40分钟后，将该探针直接注入小鼠大脑内进行成像；对照组则是在小鼠腹腔内注射盐水。从Figure 7中可以看到，注射了氟西汀的小鼠脑内红色荧光要比对照组强的多。这个实验表明，该探针有望用于筛选类似的抗抑郁药物。

结语

这篇文献报道了一个特异性检测去甲肾上腺素的红色荧光探针，并验证了它在细胞、组织、体内中的应用。荧光基团Cy7-OH进行保护后不再发荧光，而去甲肾上腺素独特的β-羟乙基胺结构可以使该荧光基团去保护，从而使荧光恢复。作者还使用这个探针实现了在钾离子刺激下去甲肾上腺素神经信号转导的成像，并首次对抗抑郁药刺激后大鼠大脑中的去甲肾上腺素水平进行实时荧光成像。该探针性质较好，有望用于更多抗抑郁药物的筛选中。

参考文献

[1] Berod, A.; Hartman, B. K.; Keller, A.; Joh, T. H.; Pujol, J. F., A new double labeling technique using tyrosine hydroxylase and dopamine-β-hydroxylase immunohistochemistry: Evidence for dopaminergic cells lying in the pons of the beef brain. Brain Research 1982, 240 (2), 235-243.
[2] Asan, E., Comparative single and double immunolabelling with antisera against catecholamine biosynthetic enzymes: criteria for the identification of dopaminergic, noradrenergic and adrenergic structures in selected rat brain areas. Histochemistry 1993, 99 (6), 427-442.