作者：石油醚
本期热点研究，我们邀请到了本文第一作者来自曼彻斯特大学的赵景明博士为我们分享。
2023年9月9日，JACS在线发表了来自曼彻斯特大学Green团队题为「Mapping the Initial Stages of a Protective Pathway that Enhances Catalytic Turnover by a Lytic Polysaccharide Monooxygenase」的研究论文。和约克大学Walton组通过合作捕捉并表征了LsAA9 LPMO氧化反应中产生的两个串联模式的重要中间体Int1和Int2，通过停流光谱，定点变异，高分辨X射线吸收光谱，电子顺磁光谱的实验手段结合TD-DFT理论计算，提出Int1可能的化学结构为铜-组氨酸自由基（Cu2+-histidyl radical），Int2的结构为铜-酪氨酸自由基（Cu2+-tyrosyl radical pair）。通过反应活性研究，作者阐释了Int1和Int2对于转移氧化损伤，保护铜催化活性中心所起的关键作用。
“Mapping the Initial Stages of a Protective Pathway that Enhances Catalytic Turnover by a Lytic Polysaccharide Monooxygenase
Jingming Zhao, Ying Zhuo, Daniel E. Diaz, Muralidharan Shanmugam, Abbey J. Telfer, Peter J. Lindley, Daniel Kracher, Takahiro Hayashi, Lisa S. Seibt, Florence J. Hardy, Oliver Manners, Tobias M. Hedison, Katherine A. Hollywood, Reynard Spiess, Kathleen M. Cain, Sofia Diaz-Moreno, Nigel S. Scrutton, Morten Tovborg, Paul H. Walton*, Derren J. Heyes*, and Anthony P. Green* J. Am. Chem. Soc.,2023, ASAP. Doi: 10.1021/jacs.3c06607”
Q1. 请对“Mapping the Initial Stages of a Protective Pathway that Enhances Catalytic Turnover by a Lytic Polysaccharide Monooxygenase”作一个简单介绍。
裂解多糖单加氧酶（LPMO）是催化多糖分子降解的高效氧化还原酶催化剂，其活性中心是由来自His1，His78和一个主链上的NH2的三个N原子与Cu2+中心配位构成的T字型铜-组氨酸组合体（copper histidine brace），此催化中心可地针对多糖底物分子C1-H键或C4-H键进行选择性氧化羟基化反应（hydroxylation），所形成的缩醛结构随后发生快速的C-O键断裂从而生成短链单糖分子产物。LPMO的氧化机理尚未清楚，类比研究较为成熟的天然铁卟啉金属酶（heme enzymes）的氧化活性中间体Compound I（高价铁氧中间体），许多DFT理论计算研究预测了LPMO催化的氧化反应过程中的活性物种为高价态铜氧中间体（Cu2+-O或Cu3+-OH），然而目前并没有实验数据捕捉并表征到这样的中间体。针对以上问题，曼彻斯特大学Green组和约克大学Walton组通过合作捕捉并表征了LsAA9 LPMO氧化反应中产生的两个串联模式的重要中间体Int1和Int2，通过停流光谱，定点变异，高分辨X射线吸收光谱，电子顺磁光谱的实验手段结合TD-DFT理论计算，提出Int1可能的化学结构为铜-组氨酸自由基（Cu2+-histidyl radical），Int2的结构为铜-酪氨酸自由基（Cu2+-tyrosyl radical pair）。通过反应活性研究，我们阐释了Int1和Int2对于转移氧化损伤，保护铜催化活性中心所起的关键作用。
Q2. 有关本次研究的时候遇到过怎样的困难呢？又是怎样克服的呢
此研究中最大的困难是中间体一Int1的表征，Int1在野生种LsAA9 LPMO的存活时间非常短暂仅50 ms，利用冷冻淬灭技术准确捕捉Int1是一大难点。我们通过制备Y164F变体来解决这一难题，苯丙氨酸F因无法像络氨酸Y一样可提供单子给Cu中心，所以Y164F变体与氧化剂混合后只形成Int1，随后Int1自行缓慢衰减而非快速转化为Int2，Y164F变体极大稳定了Int1的存活时间，给后续Int1的光谱表征带来了便利。
Q3. 本次研究主体，有没有什么让您感觉特别辛苦和烧脑呢？
最辛苦的部分是酶分子的细胞培养与蛋白质纯化，此LPMO的基因从天然真菌体系中提取出并整合到大肠杆菌表达体系内，由于蛋白质在细胞内质空间表达，随后被前端pelB leader sequence迁移至周质空间（随后pelB被切断从而释放活性His1），导致了较低的表达量，而且光谱表征中间体时需要消耗大量的酶分子溶液，因此整个课题耗时耗力（我统计出此课题所需的全部LPMO来自至少500 升大肠杆菌培养液）。最烧脑的部分是对Int1和Int2是否是活性中间体的鉴定，由于早期一些反应条件的不完善，我们开始看到了一些假阳性的实验数据，误以为Int1是活性中间体，后来经过严格系统的条件筛查，得出两个中间体都没有直接参与催化循环的结论，这个过程中的动力学分析十分复杂。但我们也发现了两个中间体参与了转移氧化损伤的保护性循环，对Y164氨基酸的重要作用有了更全面深刻的认识。
Q4. 将来想继续研究化学的哪个方向呢？
将来想开发高效的新酶分子用于有意义的有机转化反应中，通过定向进化技术大幅改造酶分子以提升其稳定性，反应活性与选择性，同时结合酶学光谱表征研究反应机理。
Q5. 最后，有什么想对各位读者说的吗？
兴趣是最好的老师，恒心与信念是最持久的动力。
作者教育背景简介
教育背景：
2018年，瑞士巴塞尔大学生物无机化学，博士，导师Prof. Thomas R. Ward
2019至今，英国曼彻斯特大学，博后，导师：Prof. Anthony P. Green
获奖经历：
2023年8月，北京大学，第13届国际华人无机化学研讨会，口头报告，最佳海报奖
2020年7月，曼彻斯特大学，第二届曼彻斯特中英青年学者峰会，最佳报告
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