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蛋白质定量——Bicinconic酸法

译自Chem-Station网站日本版 原文链接:タンパク質の定量法―ビシンコニン酸法 Protein Quantification – Bicinconic Acid Assay

翻译:炸鸡

原理

Bicinconic酸(BCA)法(Bicinconic Acid  Assay是在Lowry法的基础上进行改良的比色法,用来测定蛋白质的浓度。

相较于Lowry法用的Folin-Ciocalteu试剂,Bicinconic酸法添加了Bicinconic酸(BCA)。Cu2+经蛋白质还原生成的Cu+与BCA形成的红紫色的配合物。测量配合物在562nm处的吸光度,然后用校准曲线定量。

优点

  • 测定范围在001-2 mg/mL,灵敏度很好
  • 大范围内呈线性变化
  • 操作简单
  • 相较于Lowry法,更不容易受到表面活性剂的影响

缺点

  • 会受到螯合剂和硫醇还原剂的影响

步骤

BCA检测试剂盒可从不同的公司买到,但试剂可以用以下配方制备。

BCA试剂调制法

A液

将2,2’-联喹啉-4,4’-二甲酸二钠(10 g)、Na2CO3(20 g)、酒石酸钠(1.6 g)、NaOH(4 g)、NaHCO3(9.5 g)溶解于超纯水中,定容至1L。然后用10N NaOH水溶液将pH值调节至11.25左右。A液可在室温下保存数月。

B液

将Cu2SO4-5H2O(4 g)溶解于超纯水中,定容至100mL。B液可在室温下保存数月。

步骤

  1. 将A液和B液按体积比50꞉1的比例混合均匀(即用即配)
  2. 向每100μL的样品加入1ml1中的混合溶液,高速搅拌
  3. 37℃下静置30分钟
  4. 测定在562nm下的吸光度
  5. 以BSA为标准样品制备稀释组和校准曲线,据此计算浓度。

参考文献

  1. ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき2018, 1, 2. [PDF]
  2. “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M.  Enzymol.1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
  3. “Measurement of protein using bicinchoninic acid” Smith, P. K. et al. Biochem. 1985, 150, 76. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7

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