实验技巧

Kaiser Test

概要

如果使用固相合成来合成多肽的缩合反应没有完全进行,就会导致最后合成的多肽是各种链长的多肽的混合物。这会给多肽的提纯带来很高的难度。

为了确保这个反应的产率达到100%,有一种简便的分析方法可以用于检测多肽固相合成的缩合情况,这个方法就是Kaiser Test。就像固相合成中的TLC一样,在实验时只要仔细操作,就容易获得高收率、高纯度的多肽。(开头的图片引用自这里

原理

Kaiser Test的原理是固相上的茚三酮显色反应,该分析方法相当于检测出末端氨基。茚三酮与氨基反应产生一种Ruhemann’s purple的色素。测试过程中加入苯酚是为了调节PH值,KCN的作用是还原剂,是为了防止中间体被空气氧化[3]

试验顺序[1]

试剂与材料

试剂组虽然可以购买成品,但也可以根据个人需要从廉价的试剂中自制。混合或调制以下溶液。

试液1

茚三酮:500 mg

乙醇:10 mL

试液2

苯酚:80克

乙醇:20 mL

试液3

1mM KCN水溶液:2 mL

吡啶:100 mL

步骤

  1. 将少量固相合成树脂加入微管中,用MeOH清洗3次(去除体系里的DMF)。

2.向微管中加入试液1~3各滴1滴,100℃下加热1分钟。

  1. 如果微管内的溶液呈深蓝色到紫色,则表示存在未被反应掉的末端氨基。无色~黄色的情况,表示缩合反应已经完成。

存在未反应的末端氨基时,用同样的条件再次缩合或变更缩合条件或进行乙酰化等处理。

四氯对苯醌试验[4]

Kaiser Test原理上是不适用于检测出末端氨基是仲胺的氨基酸的(如脯氨酸和N-甲基氨基酸)。要先检测出末端氨基是非一级胺的氨基酸,要用到四氯对苯醌。

试剂与原料

试液1

乙醛:1 mL

DMF:49 mL

试液2

四氯对苯醌:1g

DMF:49 mL

步骤

  1. 将少量固相合成树脂加入微管中,用MeOH清洗3次(去除体系里的DMF)。
  2. 向微管里滴加试液1和2各一滴,室温下放置5分钟。
  3. 如果混合溶液呈现深蓝色至绿色说明还有未反应的末端氨基。如果混合溶液呈现出无色至黄色,说明缩合反应已经全部进行完毕。

NHPI试验[5]

这是一种新的检测方案,可以可逆地对树脂进行染色。NHPI试验可以检测出含有任何级数氨基的氨基酸,且氨基酸种类不受限制。而且不需要担心用到Kaiser test时用到的剧毒物氰化钾(KCN)带来的的危害,并且用于做试验的树脂可以回收利用由此不会影响总收率。该方法相比Kaiser test方法而言改善了很多。

试剂与原料

试液

  • N-羟基邻苯二甲酰亚胺(NHPI)的饱和DMF溶液(~2.7 M)

※颜色变化不明显的情况下,使用N,N’-二羟基焦美林胺(NDHPI)代替NHPI可以得到改善。

步骤

  1. 将少量固相合成树脂加入微管中,用MeOH清洗3次(去除体系里的碱)。
  2. 将试液与树脂混合,重复清洗3次。
  3. 如果清洗3次后的树脂呈现红色至褐色则表示存在未反应的末端氨基,如果树脂呈现出无色至黄色,表示缩合反应已经全部进行完毕。

(論文[5]SIより引用)

(引用自论文[5])

参考文献

  • [1] ”Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis of Peptides” Kaiser,E. T.; Colescott, R. L.; Bossinger, C. D.; Cook, P. I. Anal. Biochem. 197034, 595. doi: 10.1016/0003-2697(70)90146-6.
  • [2] ”Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction” Sarin, V. K.; Kent, S. B. h.; Tam, J. P.; Merrifield, R. B. Anal. Biochem. 1981117, 147. doi: 10.1016/0003-2697(81)90704-1.
  • [3] “A modified photometric ninhydrin method for the analysis of amino and imino acids.” Troll, W.; Cannan. R. K. J. Biol. Chem. 1953, 200, 803.
  • [4] (a) “A Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid Phase Ppetide Synthesis Using Chloranil” Christensen, T. Acta Chem. Scand. B 197933, 763.  [PDF]
  • (b) “Detection of secondary amines on solid phase” Vojkovsky, T. Pept. Res. 19958, 236.
  • [5] “Stain Protocol for the Detection of N-Terminal Amino Groups during Solid-Phase Peptide Synthesis” Suzuki, R.; Konno, H. Org. Lett. 202022, 3309. doi: 10.1021/acs.orglett.0c00445.

本文版权属于 Chem-Station化学空间, 欢迎点击按钮分享,未经许可,谢绝转载

Related post

  1. 天然产物Quassin的简洁合成
  2. 机械搅拌器
  3. 大放异彩的有机合成方法(2022)
  4. 危险试剂・取用麻烦的试剂们的方便代替品
  5. 干燥剂的种类和干燥剂在合成化学中的使用方法
  6. 实验技能分享―薄层色谱技术(TLC)
  7. 有机合成实验的一些小技巧
  8. 实验室常用溶剂怎么干燥除水?

Comment

  1. No comments yet.

  1. No trackbacks yet.

You must be logged in to post a comment.

Pick UP!

微信

QQ

广告专区

PAGE TOP