实验技巧

Kaiser Test

概要

如果使用固相合成来合成多肽的缩合反应没有完全进行,就会导致最后合成的多肽是各种链长的多肽的混合物。这会给多肽的提纯带来很高的难度。

为了确保这个反应的产率达到100%,有一种简便的分析方法可以用于检测多肽固相合成的缩合情况,这个方法就是Kaiser Test。就像固相合成中的TLC一样,在实验时只要仔细操作,就容易获得高收率、高纯度的多肽。(开头的图片引用自这里

原理

Kaiser Test的原理是固相上的茚三酮显色反应,该分析方法相当于检测出末端氨基。茚三酮与氨基反应产生一种Ruhemann’s purple的色素。测试过程中加入苯酚是为了调节PH值,KCN的作用是还原剂,是为了防止中间体被空气氧化[3]

试验顺序[1]

试剂与材料

试剂组虽然可以购买成品,但也可以根据个人需要从廉价的试剂中自制。混合或调制以下溶液。

试液1

茚三酮:500 mg

乙醇:10 mL

试液2

苯酚:80克

乙醇:20 mL

试液3

1mM KCN水溶液:2 mL

吡啶:100 mL

步骤

  1. 将少量固相合成树脂加入微管中,用MeOH清洗3次(去除体系里的DMF)。

2.向微管中加入试液1~3各滴1滴,100℃下加热1分钟。

  1. 如果微管内的溶液呈深蓝色到紫色,则表示存在未被反应掉的末端氨基。无色~黄色的情况,表示缩合反应已经完成。

存在未反应的末端氨基时,用同样的条件再次缩合或变更缩合条件或进行乙酰化等处理。

四氯对苯醌试验[4]

Kaiser Test原理上是不适用于检测出末端氨基是仲胺的氨基酸的(如脯氨酸和N-甲基氨基酸)。要先检测出末端氨基是非一级胺的氨基酸,要用到四氯对苯醌。

试剂与原料

试液1

乙醛:1 mL

DMF:49 mL

试液2

四氯对苯醌:1g

DMF:49 mL

步骤

  1. 将少量固相合成树脂加入微管中,用MeOH清洗3次(去除体系里的DMF)。
  2. 向微管里滴加试液1和2各一滴,室温下放置5分钟。
  3. 如果混合溶液呈现深蓝色至绿色说明还有未反应的末端氨基。如果混合溶液呈现出无色至黄色,说明缩合反应已经全部进行完毕。

NHPI试验[5]

这是一种新的检测方案,可以可逆地对树脂进行染色。NHPI试验可以检测出含有任何级数氨基的氨基酸,且氨基酸种类不受限制。而且不需要担心用到Kaiser test时用到的剧毒物氰化钾(KCN)带来的的危害,并且用于做试验的树脂可以回收利用由此不会影响总收率。该方法相比Kaiser test方法而言改善了很多。

试剂与原料

试液

  • N-羟基邻苯二甲酰亚胺(NHPI)的饱和DMF溶液(~2.7 M)

※颜色变化不明显的情况下,使用N,N’-二羟基焦美林胺(NDHPI)代替NHPI可以得到改善。

步骤

  1. 将少量固相合成树脂加入微管中,用MeOH清洗3次(去除体系里的碱)。
  2. 将试液与树脂混合,重复清洗3次。
  3. 如果清洗3次后的树脂呈现红色至褐色则表示存在未反应的末端氨基,如果树脂呈现出无色至黄色,表示缩合反应已经全部进行完毕。

(論文[5]SIより引用)

(引用自论文[5])

参考文献

  • [1] ”Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis of Peptides” Kaiser,E. T.; Colescott, R. L.; Bossinger, C. D.; Cook, P. I. Anal. Biochem. 197034, 595. doi: 10.1016/0003-2697(70)90146-6.
  • [2] ”Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction” Sarin, V. K.; Kent, S. B. h.; Tam, J. P.; Merrifield, R. B. Anal. Biochem. 1981117, 147. doi: 10.1016/0003-2697(81)90704-1.
  • [3] “A modified photometric ninhydrin method for the analysis of amino and imino acids.” Troll, W.; Cannan. R. K. J. Biol. Chem. 1953, 200, 803.
  • [4] (a) “A Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid Phase Ppetide Synthesis Using Chloranil” Christensen, T. Acta Chem. Scand. B 197933, 763.  [PDF]
  • (b) “Detection of secondary amines on solid phase” Vojkovsky, T. Pept. Res. 19958, 236.
  • [5] “Stain Protocol for the Detection of N-Terminal Amino Groups during Solid-Phase Peptide Synthesis” Suzuki, R.; Konno, H. Org. Lett. 202022, 3309. doi: 10.1021/acs.orglett.0c00445.

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