导读：

龚浩博士及相田卓三教授在Nature上报道了一种特定的液-液相分离（liquid–liquid phase separation）在固-液界面上发生，使近乎相同的大分子分离成同心圆。这一现象也可称为同心圆状分离（concentric partitioning）或双重液-液相分离（DLLPS）。该论文是由一个对照组实验如何促成的研究，然而究竟如何促成的呢？

“Near-identical macromolecules spontaneously partition into concentric circles.

Hao Gong*, Yuriko Sakaguchi, Tsutomu Suzuki, Miho Yanagisawa & Takuzo Aida*

Nature, 2024, 636, 92–99 doi: 10.1038/s41586-024-08203-4”

一个对照组实验如何最终促成了一篇Nature论文的发表？

[Q1.请简要介绍发表在《自然》上的研究成果，可附相关数据，如有需要也可插入视频？]

我深感感激能接受此次采访，这让我过去四年的研究成果得以公开。

我叫龚浩，是东京大学的博士后研究员，也是这篇Nature论文的第一作者兼共同通讯作者。另一位通讯作者当然就是我的博士导师、东京大学的名誉教授相田卓三。

这篇Nature论文报道了一种特定的液-液相分离（liquid–liquid phase separation）在固-液界面上发生，使近乎相同的大分子分离成同心圆。这一现象也可称为同心圆状分离（concentric partitioning）或双重液-液相分离（DLLPS）。

最初，我在研究聚乙二醇（PEGs）和蛋白质时发现了这一分离现象，随后扩展到核酸（如DNA和RNA）的分离。通过PEGs作为模型分子，构建了同心分离的机制，而在应用部分，实现了近乎相同DNA的纯化，即，这一发现实现了从其与原始DNA的1:1混合物中分离出来的纯度达97%的对人类致癌单核苷酸变体的选择性分离。

[Q2.你最喜欢这个研究项目的哪一部分？]

同心圆状分离发现的故事:

我是在博士一年级末偶然发现了这一有趣的现象。在博士第一年的大部分时间里，我在原定的研究课题上几乎毫无进展。最初收到的研究是通过化学反应来修饰一种蛋白质，以实现在缓冲溶液中的特定自组装行为。然而，直到那个夏天，在与相田教授讨论后，我们决定改变原来的策略，转而采用一种传统且冷门的方法——“盐析（通过加入盐使溶质从水溶液中分离的现象）”。就在我准备仔细研究蛋白质修饰之前，我却意外地在我的对照组分子（荧光标记的PEG）上发现了这一现象。

或许是“新手运气”作祟：由于我的“偷懒”，我在2020年9月25日下午进行了一项后续的对照组盐析实验，使用的是未经纯化的部分荧光标记PEG。当它们与盐水直接混合，简单滴加在玻璃板表面之后，我于是直接使用共聚焦激光扫描显微镜来观察玻璃板上的样品。意外的是，镜头下竟然出现了无数个类似甜甜圈的空心圆，并发出绿色荧光（图1）。按照我的常识，盐析过程中分离出的高分子最终通常会形成沉淀、凝胶或液滴，因此我本应观察到的是实心圆，而非空心圆。当时可以理解的是，这些绿色荧光空心圆的外围部分是由末端荧光标记的PEG组成的，而核心部分的成分则未知。很快，我发现这些无荧光的核心部分实际上是由未标记的反应物组成的，因为当我使用纯化后的荧光标记PEG时，观察到的只有实心圆。

随后，我的研究重点转向这些空心圆的结构：它们究竟是三维的空心球，还是二维的环？当我发现所有圆都出现在玻璃载片与盐水的界面处时，我意识到这些空心圆实际上是二维的甜甜圈。简单来说，我发现了一个仅用水、盐和玻璃板就能将结构近乎相同（有末端荧光标记和没有末端荧光标记）的高分子混合物迅速分离成同心圆的方法。

在接下来的两年多时间里，通过一系列实验和与合著者之一柳澤実穂副教授的深入讨论，我最终厘清了这种分离现象的机制。简而言之，同心圆状分离包含两个连续的分离过程（图2）：第一次分离发生在液体溶液中（盐析），而第二次分离发生在固-液界面上，由界面自发形成的盐层触发。由于这项研究来源于一个意外的发现，而非预先计划的项目，考虑到我的整体贡献，相田教授发现此现象不久之后告知我，我将作为这项研究的通讯作者之一。

图1：使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可视化末端结构不同的PEGs的同心圆状分离。

图2：通过双重液-液相分离（DLLPS）对近乎相同的水溶性大分子进行同心圆状分离的概念与过程示意图。

[Q3. 在这项研究中，最困难的部分是什么？您是如何克服它的？]

最困难的部分是同心圆状分离的实际应用部分的完成。

最初的实际应用部分是通过“盐溶（salting-in）”来选择性提取末端结构不同的PEGs来实现的。这一内容被包含在我们于2022年11月20日向Nature提交的初稿中。然而，不幸的是，该稿件在次年1月10日被拒稿，三位审稿人评审后给出了意见。 Nature的编辑告诉我们，虽然审稿人都认为此观察结果很有趣，但是机理部分是欠缺的，分离应用部分是有局限的。考虑到这是一个处于发展阶段的研究，因此我们决定不再对该稿件进一步审阅。除了上述评论，我们还收到了总计近40条具有建设性的修改建议。

从那一刻起，我彻底从PEGs的分离转向了DNAs的分离。最初，我使用的DNA序列并不来自任何生物体的基因序列。因此，在半年后的一次组会上，当我被问及为什么选择这些没有生物学意义的序列时，我才意识到，由于自己最初的决策，之前的大量工作几乎都是徒劳的。因此，我不得不重新选择研究有意义的DNA序列。这一次，我选择了来自人类 BRAF 基因的序列，由于该基因在发生单点突变时会导致多种人类肿瘤和癌症。

尽管这次的DNA序列具有生物学意义，但我们当时仍旧缺乏检测这些近乎相同结构的方法。与末端标记的PEG不同，这些DNA既没有染料修饰，也不吸收可见光，这意味着即使我们成功纯化了它们，也无法量化其纯度。2023年9月，在相田教授的介绍下，我联系了本系RNA与质谱分析专家铃木勉教授。在他的博士后研究员坂口女士的帮助下，我成功通过质谱分析明确确认了来自同心圆状分离样品的DNA提取物的比例。经过无数次繁琐的提取实验，直到2024年5月，这一研究的最后一块拼图才最终完成。此后的论文撰写及向Nature重新投稿过程则进行得非常顺利。

[Q4. 您未来在研究方面的目标是什么？]

由于提出的同心圆状分离理论是一个全新的理论，我首先希望能够继续完善这个理论，同时也希望这一突破性的发现能够改变学术界对液-液相分离以及固-液界面的传统认知，从而对该领域的进一步研究产生积极影响。

关于未来的应用，现有的基因诊断方法（如基于毛细管电泳的桑格测序技术）通常需要半天甚至几天才能完成。因此，相田教授和我希望这一发现能够应用于生命科学领域的精准核酸分离技术。

[Q5.您想给读者说些什么？]

我衷心感谢所有对这项研究感兴趣的读者。这项工作不仅代表了科学发现本身，还凝聚了实现这一成果所需的坚持、好奇心和合作精神。

科学发现往往充满未知，我在探索同心圆状分离的过程中深刻体会到了这一点。从最初的意外观察，到深入的机理研究，再到最终的实际应用，这段旅程正是科研道路上不确定性与探索精神的体现。我希望这个故事能够激励那些在科研中遇到挫折的人们。

科学进步的另一个关键因素是主动而无畏的学术讨论。开放的对话和建设性的争论不仅有助于完善想法、挑战固有假设，也能推动新的发现。因此，我鼓励每一位研究者，尤其是处于早期阶段的科研工作者，积极寻求反馈，与同行和导师展开深入交流。

最后，我再次衷心感谢我的博士导师——东京大学名誉教授相田卓三，感谢他在这段旅程中始终给予我的支持和指导，使我得以将这一原本只是小小的发现拓展为一篇重要的Nature论文。

[关于作者]

龚 浩：博士后

研究方向：软物质科学、超分子化学、液-液相分离、乳液

[Prof. Aida评述]

龚浩博士在中山大学王娇炳博士的实验室完成本科研究，王博士曾是我实验室的博士后。随后，他以硕士生身份加入Aida实验室，在理化研究所开始研究工作。但因种种原因，他与我的联系逐渐减少，期间一度混乱：忘记报名博士入学考试，导致延迟半年；又用日语提交JSPS申请，面试后被拒。我问他是否愿转至我在东京大学的基础实验室攻读博士，他同意并搬至本乡（Hongo）。可见，他性格自由，不适应高度规范的环境，却充满好奇心，对热爱之事全力以赴——无论是带着大尺寸单反走遍日本，还是购置专用相机彻夜观测星空。

在东京大学，我安排他研究长期由我实验室深耕的分子伴侣GroEL。研究中，他发现一个奇特现象：向GroEL与其他蛋白的混合物加入高浓度硫酸铵后，蛋白液滴中心始终出现颗粒状物质。当我追问细节，他仅模糊回应：“可能是GroEL。”后来，他在对末端带染料的聚乙二醇（PEG）进行共聚焦成像时，观察到高浓度硫酸铵下，玻璃基底上附着大量中心变暗的环状结构。他推测是未标记染料的PEG污染样本，形成非荧光的暗核，并验证了这一假设。此时，他的科研动力全面启动，全身心投入揭示这一全新现象，不断精进能力，频繁与我讨论，我也指出所有不符传统认知之处。我们还与东京大学驹场校区的米保柳濑教授展开合作。

随着研究深入，我们向《自然》投稿。尽管评审意见严苛，编辑更要求展示核酸等生物大分子的分离应用，龚博士虽受挫却拒绝改投他刊，反而加倍投入。在Prof. Tsutomu Suzuki’s lab，提供核酸质谱支持下，论文最终被接受。此时的他，已不再是四年前初到本乡的那个散漫学生。他将最初微小的观察反复打磨，最终升华为“双液-液相分离”这一普遍现象。这段经历成为他成长为顶尖科学家的关键驱动力。我期待这位才华横溢的年轻学者未来的更多成就。

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