实验技巧

薄层色谱法PTLC(Preparative Thin-Layer Chromatography)

译自Chem-Station网站日本版 原文链接:分取薄層クロマトグラフィー PTLC (Preparative Thin-Layer Chromatography)

翻译:炸鸡

最近笔者教研究生怎么用薄层色谱法(俗称爬大板子,Preparative Thin-Layer Chromatography)分离提纯,借这个契机笔者想来好好聊聊怎么爬大板子。不同实验室之间爬大板子的方法或许稍有差异,本篇所讲的仅代表我个人的做法。如果读者有更好的爬板子的方法请尽情留言哦。

特点

PTLC(俗称爬大板子),即在比TLC厚的硅胶板上刮下展开条带,再用溶剂提取出条带里被吸附的化合物。它的缺点和优点总结如下。

缺点

  • 会有因化合物在板子上分解或刮下来的硅胶有损失导致分离收率下降的情况出现
  • 不适用于提纯在板子上不稳定的化合物(稳定与否需要二维TLC确认)
  • 分离的量有限,不适用于大反应量的反应
  • 不是不可以提纯没有UV吸收的化合物,但不太适合

优点

 

  • 操作简便
  • 只要展开剂适宜就能分离得很干净
  • 有时会因为板子的硅胶目数与硅胶柱的硅胶目数有差异而导致板子的精制效果更好
  • 有时第一次过柱子分不开的话,爬大板子能很快地分开

准备工作

干净的实验台(实验台如果不干净会导致你的产物被污染。即使从安全的角度看也得保持实验台干净);PTLC(大板子),厚度0.5 mm,面积10 x 20 cm或20 x 20 cm;溶解样品极性溶剂;尖头滴管;展开溶剂(50ml左右);展缸;溶出溶剂;美工刀;刮硅胶用的刮刀;漏斗或滴管。

准备展开槽和处理样品

准备TLC上令目的物Rf值在0.4-0.5的展开剂50ml,倒入展缸(展开剂在展开槽的高度有1cm就足够了,展开剂太多的话会浸渍原点的,请注意)让展缸充满展开剂的蒸气。如果展缸内有滤纸展开速度会更快。

用尽可能小的烧瓶装样品,用尽可能少量的溶剂去溶解样品。(一块板子对应的溶解溶剂量约为0.4ml,这个溶剂量对于要重复上两次样的板子来说也是最合适的)

PTLC的选择

PTLC大部分由Merck Millipore公司生产,规格有0.5毫米、1.0毫米和2.0毫米。 购买时,根据应用情况选择是否含有荧光剂。当然,PTLC是相当昂贵的,所以你也可以用玻璃板和含F254指示剂的硅胶来自制PTLC。为了追求更好的分离效果,你也可以尝试市面上的有着均匀硅胶粒的HPTLC(High Perfromance Thin-Layer Chromatography)。(实际上,HPTLC比PTLC还要贵,而且厚度仅为0.2毫米,在分离量上来说远远不能满足现实需求。所以理论上,在用PTLC分离效果不好的情况下,用反相HPLC或HPLC来分离。如果还是分离不干净,可以使用手性色谱柱,因为它们在某些方面的分离效果比反相色谱柱更好。)此外,如果想要追求大量精制且分离效果良好的话,建议试试粒度整齐的柱子,如Biotage的SNAP Ultra的硅胶柱。用什么硅胶柱子依每个实验室的设备和分离情况而定。

PTLC的厚度和枚数的选择。虽然Merck Millipore网站建议0.5 mm厚的PTLC最多负载50mg的化合物,但实际上如果真的负载了50mg化合物,分离效果将会大打折扣,如果想要提高分离效果就得减小负载的产物量。所以即便0.5 mm厚度对应负载20mg,1.0 mm厚度对应负载40mg,但我建议0.5mm的厚度负载10mg以下,在1.0mm厚度负载20mg以下。在笔者的实验室里,我们使用切成两半的0.5毫米PTLC,因为它们展开速度快,分离效果好。

实际实验方法:0.5mm厚的PTLC(10 x 20cm的一半)被点上5mg的样品,然后展开。在这种情况下,展开高度为10cm。在这个例子中,分离的要求相当高,所以第一次分离后的精制物还要用低极性的混合溶剂进行二次展开。

上样

初学者可以用铅笔在5mm高的地方水平画一条线,上样的时候沿着这条线操作会比较容易。(练熟了就不用这么干了,因为太繁琐了)

在两边各留出5毫米的空间,用尖头滴管将样品溶液均匀地涂抹在PTLC上。 如果涂抹地不够快样品溶液可能会溢出(当使用低沸点溶剂如乙醚时,由于蒸汽压力,样品溶液很容易滴落),如果是新手应该提前用溶液模拟练习几次。在某些情况下,可以用沸点稍高的氯仿来溶解样品,相应的,氯仿需要更长的时间来干燥,但可以更稳妥地涂抹在PTLC上。

上样的方法:1)利用稍粗的玻璃毛细管的毛细作用将浓缩的样品加入到HPLC样品瓶中;2)用打火机将滴管的尖头烧尖然后上样;3)小心翼翼地直接用滴管上样;4)用棉花填充滴管的尖端,利用毛细作用上样(最常用的方法) 5)用注射器和针头涂抹。(这或许是欧洲最常见的方法?) ,总之上样的方法五花八门,但最后,只要能均匀上样,采用什么方法你任意。

干燥PTLC板。在另一个展开槽内倒入醚类/乙酸乙酯等极性溶剂预展开并画好溶剂前端线。(预展开并不需要点样点的很完美)待板子上的极性溶剂彻底挥发干净了,再正式展开。

展开和刮板

把板子放在充满溶剂蒸气的展开槽内展开。待溶剂爬到溶剂前端线时及时取出板子以防不同条带再次混合,让取出的板子干燥。展开时间因展开溶剂而异。

如果展开溶剂是卤素溶剂,因为卤素溶剂挥发很快的原因,比方说溶剂前端线高20cm,卤素展开剂往往都到不了20cm高的高度,这样就不要勉强了。如果追求较好的分离效果,那就选用令Rf值小的展开溶剂,进行多次展开(一次展开后,干燥,再放入展缸展开)。(有一个技巧,当展开到10cm的高度时,取出板子,干燥,切下Rf值比目的化合物小的杂质部分所在的PTLC板,然后将剩余的部分多次展开)

展开结束后,板子干燥后在UV灯下确认吸收条带,用铅笔标记目的物的条带。如果目的物没有UV吸收,在板子中央剪下宽约1cm的长条,用适宜的显色剂将长条染色以确认目的化合物的位置。(没有UV吸收的化合物如果在板子上浓度很高的话会在UV灯下显出一条很薄的条带,用显色剂确认条带位置是个很好的参考方法)

用切割器、剃刀或刮刀刮下所需的条带。 将刮下的硅胶转移到干净的A4纸或称量纸上。要注意不要让 刮下来的硅胶随风飞走。(比方转移硅胶的时候拉下了通风橱的门,硅胶也就随风而去了的惨剧)。必要时要将刮下的硅胶颗粒研碎,依据刮下来硅胶的量选择漏斗之类的容器盛装硅胶以防飞走。

尽快刮下任何你认为含有目的物的条带,因为时间一长化合物很可能在板子上分解。如果你不确定你的目的化合物是否在板子上稳定,可以在爬板子前用二维TLC确认一下。

过滤

用一个玻璃过滤器进行减压过滤。在这种情况下,没有必要事先碾碎硅胶颗粒,可以在慢慢倒入溶剂后,用注射器或小瓶的瓶腹压碎硅胶。

硅胶量很少的时候(比如过一张0.5mm厚的板子刮下的硅胶量),碾碎硅胶然后用浸出溶剂浸泡(有时要把溶有硅胶的悬浊液送去超声一下),然后通过尖端塞有棉花的滴管滤出。过滤的时候可以将滴管尖端折断一部分为了更快过滤,用较多的棉花塞住可以避免硅胶堵塞滴管。收集到目的物后就可以丢弃滴管了。一般来说用三倍硅胶体积的溶剂就可以浸出吸附在硅胶里的所有化合物了。

如果没有漏斗但硅胶量又很大,可以用柱子过滤。关键是使硅胶层尽可能地薄,因为PTLC板的硅胶的颗粒比普通柱子230-400目的硅胶颗粒的更细。在倒入刮下的硅胶前倒入海沙以免避免硅胶污染溶液。

极性溶剂(乙醚、乙酸乙酯、30%甲醇)常被用作浸出溶剂,因为它们能溶解化合物且Rf值很高。当甲醇被用作洗脱剂时,无机物如微量的碳酸钙可能会被洗脱,所以应注意浸出溶剂中甲醇的含量不得超过30%。浸出化合物通常用过量的洗脱剂,所以要使用高纯度的溶剂作为洗脱剂。

最后减压蒸发洗脱剂即可。

同时过6PTLC

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